Школа 15 быковская: Муниципальное бюджетное общеобразовательное учреждение Быковская средняя общеобразовательная школа №15

Содержание

Полная база контрактов МУНИЦИПАЛЬНОГО ОБЩЕОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ БЫКОВСКАЯ СРЕДНЯЯ ОБЩЕОБРАЗОВАТЕЛЬНАЯ ШКОЛА №

Поставщик

Акционерное общество “Раменская теплосеть”

Предмет

Коммунальные услуги по отоплению

Дата заключения

1 января 2020 года

Дата окончания исполнения

31 декабря 2020 года

Сумма контракта

2 575 962,77 ₽

Поставщик

АКЦИОНЕРНОЕ ОБЩЕСТВО “РАМЕНСКАЯ ТЕПЛОСЕТЬ”

Предмет

Услуги по транспортированию горячей воды

Дата заключения

1 января 2021 года

Дата окончания исполнения

31 декабря 2021 года

Сумма контракта

2 569 992,70 ₽

Поставщик

Общество с ограниченной ответственностью “РАМКЕЙТ”

Предмет

Услуги по организации питания

Дата заключения

4 февраля 2020 года

Дата окончания исполнения

31 декабря 2020 года

Сумма контракта

2 313 494,40 ₽

Поставщик

ООО “РАМКЕЙТ”

Предмет

Услуги по обеспечению питанием, осуществляемые по договору, прочие

Дата заключения

13 января 2019 года

Дата окончания исполнения

31 декабря 2019 года

Сумма контракта

2 259 300,00 ₽

Поставщик

ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ ЧАСТНАЯ ОХРАННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ “ФОРТУНА”

Предмет

Оказание услуг по физической охране (2 поста)

Дата заключения

9 февраля 2021 года

Дата окончания исполнения

31 декабря 2021 года

Сумма контракта

1 980 000,00 ₽

Поставщик

ООО ЧОО “Криптон”

Предмет

Оказание услуг по организации охраны и контрольно-пропускному режиму на территории муниципального общеобразовательного учреждения

Дата заключения

12 февраля 2020 года

Дата окончания исполнения

31 декабря 2020 года

Сумма контракта

1 900 800,00 ₽

Поставщик

ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ ЧАСТНАЯ ОХРАННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ “ФЛАГМАН”

Предмет

Оказание услуг по организации охраны и контрольно-пропускному режиму на территории муниципального общеобразовательного учреждения

Дата заключения

15 января 2019 года

Дата окончания исполнения

31 декабря 2019 года

Сумма контракта

1 900 800,00 ₽

Поставщик

Общество с ограниченной ответственностью Частная охранная организация “Криптон”

Предмет

Оказание услуг по организации охраны и контрольно-пропускному режиму на территории муниципального общеобразовательного учреждения

Дата заключения

20 января 2018 года

Дата окончания исполнения

31 декабря 2018 года

Сумма контракта

1 748 000,00 ₽

Поставщик

ООО “КСЕ стройсанэлтех”

Предмет

ремонт сантехсистем

Дата заключения

22 июля 2013 года

Дата окончания исполнения

Сумма контракта

1 707 639,76 ₽

Поставщик

МУП “Общепит”

Предмет

Питание

Дата заключения

11 января 2017 года

Дата окончания исполнения

31 декабря 2017 года

Сумма контракта

1 607 265,00 ₽

МБОУ “Быковская средняя общеобразовательная школа” МО “Булунский улус (район)” Республика Саха (Якутия)

Свежие новости

Недавно загруженные документы

  •  
  •  
  •  
  • Кросс Нации (Загружено на сайт 22 октября в 05:32 | Размер 421,2 Kb)
  •  
  • Кросс Нации (Загружено на сайт 22 октября в 05:31 | Размер 421,2 Kb)
  •  
  •  
  •  
  •  
  • 2021-10-18-sm (Загружено на сайт 18 октября в 05:43 | Размер 10,4 Kb)
  •  
  • 2021-10-15-sm (Загружено на сайт 18 октября в 05:43 | Размер 10,4 Kb)
  •  
  • 2021-10-13-sm (Загружено на сайт 18 октября в 05:43 | Размер 10,3 Kb)
  •  
  • 2021-10-14-sm (Загружено на сайт 18 октября в 05:43 | Размер 10,3 Kb)
  •  
  • 2021-10-12-sm (Загружено на сайт 18 октября в 04:46 | Размер 10,4 Kb)
  •  
  • 2021-10-11-sm (Загружено на сайт 18 октября в 04:46 | Размер 10,4 Kb)
  •  
  • 2021-10-08-sm (Загружено на сайт 18 октября в 04:44 | Размер 10,3 Kb)
  •  
  • 2021-10-06-sm (Загружено на сайт 18 октября в 04:44 | Размер 10,4 Kb)
  •  
  • 2021-10-07-sm (Загружено на сайт 18 октября в 04:44 | Размер 10,4 Kb)
  •  
  • 2021-10-05-sm (Загружено на сайт 18 октября в 04:40 | Размер 10,1 Kb)
  •  
  •  
  •  
  •  
  • Приказ (Загружено на сайт 30 сентября в 05:16 | Размер 785,9 Kb)
  •  
  •  
  •  
  •  
  • 2021-09-16-sm (Загружено на сайт 16 сентября в 04:43 | Размер 10,3 Kb)
  •  
  • 2021-09-15-sm (Загружено на сайт 15 сентября в 03:32 | Размер 10,3 Kb)
  •  
  • 2021-09-14-sm (Загружено на сайт 14 сентября в 06:41 | Размер 10,4 Kb)
  •  
  • 2021-09-13-sm (Загружено на сайт 13 сентября в 07:35 | Размер 10,3 Kb)
  •  
  • 2021-09-10-sm (Загружено на сайт 11 сентября в 02:47 | Размер 10,3 Kb)
  •  
  • 2021-09-09-sm (Загружено на сайт 11 сентября в 02:47 | Размер 10,3 Kb)
  •  
  • 2021-09-08-sm (Загружено на сайт 8 сентября в 09:04 | Размер 10,2 Kb)
  •  
  • 2021-09-07-sm (Загружено на сайт 7 сентября в 07:27 | Размер 10,4 Kb)
  •  
  • 2021-09-06-sm (Загружено на сайт 6 сентября в 07:59 | Размер 31,5 Kb)
  •  
  • 2021-09-03-sm (Загружено на сайт 6 сентября в 07:59 | Размер 31,5 Kb)
  •  
  •  
  •  
  •  
  • 2021-05-28-sm (Загружено на сайт 28 мая в 06:30 | Размер 10,4 Kb)
  •  
  • 2021-05-27-sm (Загружено на сайт 28 мая в 06:30 | Размер 10,3 Kb)
  •  
  • 2021-05-26-sm (Загружено на сайт 28 мая в 06:30 | Размер 10,3 Kb)
  •  
  • 2021-05-25-sm (Загружено на сайт 28 мая в 06:29 | Размер 10,4 Kb)
  •  
  • 2021-05-24-sm (Загружено на сайт 24 мая в 11:15 | Размер 10,3 Kb)
  •  
  • 2021-05-21-sm (Загружено на сайт 24 мая в 11:15 | Размер 10,4 Kb)
  •  
  • 2021-05-20-sm (Загружено на сайт 20 мая в 09:27 | Размер 10,4 Kb)
  •  
  • 2021-05-19-sm (Загружено на сайт 20 мая в 09:20 | Размер 10,3 Kb)
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  • internet-bezopasnost (Загружено на сайт 1 апреля в 06:15 | Размер 4,8 Mb)
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  • ОГЭ ИУС (Загружено на сайт 11 марта 2020 в 02:32 | Размер 15,1 Kb)
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  • Устав (Загружено на сайт 27 февраля 2020 в 21:54 | Размер 3,5 Mb)
  •  
  • ИНН (Загружено на сайт 27 февраля 2020 в 21:44 | Размер 128,6 Kb)
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  
  •  

Сайт школы МБОУ СОШ №15 г.

Сергиев Посад

УПРАВЛЯЮЩИЙ  СОВЕТ

МБОУ «Средняя общеобразовательная школа №15»

Положение об Управляющем Совете

2021-2022 учебный год.

  1. Быковская Ирина Валентиновна- председатель Управляющего Совета
  2. Левченко Ольга Владимировна-директор школы
  3. Шевелева Наталья Витальевна-социальный педагог
  4. Санцевич Елена Георгиевна-от родителей обучающихся 10-11 классов
  5. Ховрачев Алексей Петрович-  о родителей обучающихся 5-9 классов
  6. Иващук Лариса Евгеньевна-от родителей обучающихся 1-4 классов
  7. Трошина Наталья Анатольевна- от общественности
  8. Иванова Полина-от обучающихся 10 классов
  9. Остапчук Степан- от обучающихся 11 классов

 

2020-2021  учебный год.

  1. Быковская Ирина Валентиновна- председатель Управляющего Совета
  2. Левченко Ольга Владимировна- директор школы
  3. Шевелева Наталья Витальевна-социальный педагог
  4. Крюкова Светлана Валентиновна- от родителей 1-4 классов
  5. Иващук Лариса Евгеньевна
  6. Ховрачев Алексей Петрович-от родителей 5-9 классов
  7. Петровская Татьяна Юрьевна- от родителей 10 класса
  8. Плаксина Алина- от учащихся 10 класса

 

2019– 2020 учебный год

  1.  Быковская Ирина Валентиновна – председатель Управляющего совета.
  2.  Левченко Ольга Владимировна – директор школы.
  3.  Шевелева Наталья Витальевна – социальный педагог
  4.  Титова Ольга Николаевна – от родителей учащихся 10-11 классов
  5.  Ховрачев Алексей Петрович – от родителей учащихся 5-9 классов.
  6.  Крюкова Светлана Валентиновна – от родителей учащихся 1-4 классов
  7.  Иващук Лариса Евгеньевна – от родителей учащихся 1-4 классов
  8.  Подрубалова Яна – от учащихся 11 класса

 

 

 

 

 

ОСНОВНЫЕ СВЕДЕНИЯ | МБОУ “СОШ” с.Быков

Полное наименование образовательной организации

Муниципальное бюджетное общеобразовательное учреждение  «Средняя общеобразовательная школа» с. Быков Долинского района Сахалинской области

Сокращенное наименование образовательной организации

МБОУ «СОШ» с. Быков

Дата создания образовательной организации

1947 год — в п. Быков образована начальная школа, в 1948 году преобразована в семилетку, в 1952 году — в среднюю

Учредитель образовательной организации

Администрация МО ГО «Долинский» Сахалинской области Российской Федерации

Мэр МО ГО «Долинский» Тугарев Александр Валерьевич

Функции и полномочия учредителя исполняет  МКУ «Управление образования, культуры, физической культуры и спорта и молодежной политики» МО ГО «Долинский» Сахалинской области Российской Федерации

Адрес: 694051,  Российская Федерация,  Сахалинская область, Долинский район,  г. Долинск, ул. Комсомольская, дом 46.

Телефон: 8 (42442) 28-5-13

 E-mail: [email protected][email protected]

Официальный сайт: www.edudolinsk.ru

Директор Управления МКУ «Управления ОКС» МО ГО «Долинский» : Белякова Г.К.

Начальник отдела функционирования и развития образования МКУ «Управление ОКС»:   Юн Кым Оки

Специалисты: Тян И.Г.,  Демина Е.В., Бондарик О.П., Бурик О.Н.

Наименование представительств и филиалов образовательной организации

Представительств и филиалов нет

Местонахождение образовательной организации
  • Юридический адрес МБОУ «СОШ» с. Быков: 694062, Российская Федерация, Сахалинская область, Долинский район, с. Быков, ул. Шахтерская, д. 15
  • Фактический адрес МБОУ «СОШ» с. Быков: 694062, Российская Федерация, Сахалинская область, Долинский район, с. Быков, ул. Шахтерская, д. 15
Режим и график работы образовательной организации

Школа работает с 8-00  до 20-00 часов в одну смену, вторая половина дня отведена на проведение факультативных и элективных курсов, реализацию программ внеурочной деятельности и дополнительного образования. Школа функционирует в режиме пятидневной учебной недели.

Режим занятий обучающихся

Прием по личным вопросам администрацией

Дни недели Время ФИО Должность
понедельник 1500-1700 Адиятуллина Т.Х. Зам. директора по ВР
вторник 1500-1700 Николаева О.А. Зам. директора по УМР
среда 1500-1700 Упорова У.Ю. Зам. директора по УВР
четверг 1500-1700 Попова Е.Н. Зам. директора по УВР
пятница 1500-1700 Зубко Л.А. Директор
Контактные телефоны образовательной организации

+79147551213, 251213- приемная

Адрес электронной почты образовательной организации

dgo. [email protected]       

Адрес официального сайта образовательной организации

bukovsosh.ru

Места осуществления образовательной деятельности образовательной организации

694062, Российская Федерация, Сахалинская область, Долинский район, с. Быков, ул. Шахтерская, д. 15

МКОУ Быковская СШ №1 – Ошколе.РУ

ПРИЕМ ГРАЖДАН ПО ЛИЧНЫМ ВОПРОСАМ:

Понедельник: 15:00 час – 17:00 час
Четверг: 15:00 час – 17:00 час

Телефон горячей линии по вопросам незаконных сборов денежных средств в общественных организациях 8-84495-3-29-09

На территории Волгоградской области действует служба экстренной психологической помощи «Детский телефон доверия» с единым общероссийским номером 8-800-2000-122, с целью оказания экстренной психологической помощи детям, подросткам и их родителям, осуществляющая свою работу в круглосуточном режиме (Телефон доверия, http://minobr34. ru,http://www.vodkpb.ru/?page_id=378)

Обращаем Ваше Внимание!
На основании приказа Минобрнауки России ” Об утверждении примерной формы договора об образовании по образовательным програмам начального общего, основного общего и среднего общего образования” предоставляем примерную форму договора об образовании по дополнительным образовательным программам.
договор прилагается: ссылка на скачивание
МКОУ “Быковская СШ №1” платные образовательные услуги НЕ ОКАЗЫВАЕТ!

Карта партнёра: ссылка на скачивание

ПОСТАВЬ ОЦЕНКУ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ

Инструкция по оценке учреждения

Уважаемые родители, законные представители обучающихся в МКОУ “Быковская СШ №1”!

В рамках проведения независимой оценки качества условий осуществления образовательной деятельности образовательных организаций Быковского района Волгоградской области, просим пройти онлайн-анкетирование на сайте: н-о-к.рф.

(срок анкетирования до 19 апреля 2019 г. )

Краткая инструкция:

Шаг 1. Перейдите на информационный ресурс (сайт) н-о-к.рф (набрав н-о-к.рф в поисковой строке) или перейдите по ссылке   http://н-о-к.рф/

Шаг 2. На главной странице выберите ОБРАЗОВАНИЕ;

Шаг 3. На странице ОБРАЗОВАНИЕ внизу перейдите по ссылке ЗАПОЛНИТЬ АНКЕТУ;

Шаг 5. В открывшемся окне выберите букву «В»

Шаг 6. В раскрывшемся списке выберите Ваш регион Волгоградская область

Шаг 7. В открывшемся окне выберите Ваш район: Быковский;

Шаг 8. Открылась АНКЕТА, отмечайте варианты ответов из предложенных, в завершении выбирая ОТПРАВИТЬ.

 

 

 

 

 

 

 

 

2-я Международная школа молодых ученых «Межфазные явления и теплообмен», 12-16 сентября 2017 г. Новосибирск, Россия

Гостиница

Всем участникам настоятельно рекомендуется размещение в гостинице Сибирского отделения Российской академии наук «Золотая долина», расположенной в пешей доступности от мест проведения конференций (5 минут пешком от Дома ученых СО РАН и 20 минут пешком. из Института теплофизики им. Кутателадзе СО РАН).Вы можете выбрать от бюджетного одноместного номера до роскошной квартиры. Отель предоставляет завтрак и доступ в Интернет за разумную дополнительную плату.

Для участников конференции «Золотая долина» предлагает специальные тарифы с примерно 20% скидкой от стандартных цен. Все цены указаны в российских рублях и включают все налоги и сборы. Чтобы узнать цены в вашей валюте, вы можете использовать эту ссылку на конвертер валют.

Для того, чтобы забронировать номер в «Золотой долине» по специальному тарифу, необходимо:

1.Быть зарегистрированным участником конференции.

2. Заполните и отправьте форму бронирования гостиницы & nbsp доктору Елене Быковской по электронной почте [email protected] не позднее 20 августа 2017 года.

3. Если ваши планы внезапно изменятся, как можно скорее свяжитесь с доктором Еленой Быковской по электронной почте [email protected] nsc.ru. .

4. Получите визу, как описано здесь.

5. Оплатите номер наличными или кредитной картой на стойке регистрации отеля по прибытии.

Пожалуйста, сделайте заказ как можно раньше.

В Новосибирске есть и другие хорошие отели, но они находятся не менее чем в 40 минутах езды от места проведения конференции и не предоставляют скидки. Если по каким-либо причинам «Золотая долина» Вам не подходит, обратитесь к доктору Елене Быковской по электронной почте [email protected]

Второй тип жилья – университетское общежитие. 15 мин пешком от места проведения конференции.

В каждой комнате по две кровати.Стоимость одной кровати 700 руб. / Сутки. Нет бесплатного интернета. Завтрак в студенческом кафе. Оплата только наличными. Финансовые документы будут предоставлены по запросу.

Если Вы желаете получить такой вариант проживания, обращайтесь к Елене Быковской по электронной почте

[email protected] nsc.ru.

Bearcats продолжают победные пути, завоевывают еженедельные теннисные награды – AmericaEast.com

КЕМБРИДЖ, Массачусетс – Бингемтонский университет младший Свен Влоэдгравен (Лохем, Нидерланды / Изендорнский колледж) помог №52 Bearcats одержали две победы в воскресенье, увеличив свою победную серию до рекордных 13 матчей, чтобы претендовать на звание лучшего теннисиста недели. Второкурсница Bearcat Марина Быковская (Саратов, Россия / Средняя школа 8) помогла женщинам принять два близких решения 4: 3, чтобы получить награду теннисистки недели за неделю, закончившуюся 6 апреля.

Влоэдгравен в сумме показал идеальный результат 4: 0. в одиночном и парном разряде № 1 в воскресенье, чтобы привести Bearcats 18-1 к победе над № 74 Западный Мичиган, 4-0, и Баффало, 5-2.Он проиграл всего семь игр в четырех сетах одиночных игр и в этом году набрал 31-8 очков в одиночном разряде и 16-3 в парных матчах. Влоэдгрейвен также показывает 23-8 в парном разряде в этом сезоне и 15-4 в парных матчах после двух побед в парном разряде с партнером-второкурсником Гилбертом Вонгом (Гонконг / Епархиальная школа для мальчиков) в воскресенье.

Быковская помогла женщинам Bearcat подать иск по паре решений 4–3 против членов Colonial Athletic Association Ричмонда и UNC-Wilmington за неделю. Заняв первое место в парном разряде, Быковская в паре с Эдельманом набрала двойное очко в обоих матчах команды, улучшившись в целом до 20-4 в парном разряде в этом сезоне.В одиночном разряде Быковская отскочила в третьем сете против Ричмонда и одержала одну из трех побед Bearcats в одиночном разряде. Против UNC-Wilmington она одержала чистую победу на шестом месте в одиночном разряде, что помогло Бингемтону улучшиться до 10-2 в сезоне.

Мужская команда Бингемтона продолжает подниматься в рейтинге, поднявшись с 59 на 52 место в национальном рейтинге ITA на этой неделе. Рейтинг Bearcat – самый высокий за всю историю программы.

Олбани – Доги пошли со счетом 0: 3 за неделю во время весенних каникул во Флориде.Олбани впервые встретился с Джексонвиллем в среду, проиграв 7: 0. Джэксонвилл увеличил количество очков в двойном разряде и привел импульс в одиночный разряд. Джуниор Сьюзан Ма (Парквилл, Миссури / Парк-Хиллз Саут) была единственной немецкой догой, которая выиграла сет в среду, выиграв первый сет, заняв третье место в одиночном разряде, прежде чем упасть на тай-брейке с 10 очками вместо третьего. установленный. Датчане встретились с Миссури и Канзасом, проиграв решением судей 5: 2. В то время как юниоры Ливия Герман (Залау Салаж, Румыния / штат Вашингтон / Колегиул Нэшнл Сильвания) и Лайн Макки (Ливуд, Кан./ Shawnee Mission) одержал победу на первом месте в парном разряде, Олбани не смог удержаться до двойного очка, проиграв на 2-м и 3-м позициях. Затем Герман одержал победу в одиночном разряде и занял первое место, вернувшись из набора для победы. Первокурсница Сара Ианноне (Северный Ванкувер, Британская Колумбия / Средняя школа Сейкова) набрала второе очко для команды с прямой победой на шестой строчке в одиночном разряде. В последнем матче поездки «Олбани» проиграла «Флориде Атлантик» со счетом 7: 0. Макки и Герман заявили о единственной победе датчан, заняв первое место. 1 дубль. Олбани возвращается к действиям 9 апреля против Массачусетса.

Бингемтон – 52-е место среди бойцов Bearcat улучшилось до 18-1 в сезоне с двумя победами в воскресенье над 74-м номером в Западном Мичигане (4-0) и Баффало (5-2). С двумя победами «Бингемтон» увеличил свою победную серию до рекордных 13 матчей, побив предыдущий рекорд в 12, установленный командой 2004-05 годов. Bearcats сначала сыграли в Broncos. Бингемтон взял двойное очко, чтобы начать матч с побед на двух верхних позициях. Юниоры Арнав Джайн (Мумбаи, Индия / Дж.M.L School), Свен Влоэдгравен и старший Моше Леви (Раананна, Израиль / Де-Карт), затем каждый из захваченных одиночных игр выигрывает, чтобы завершить матч за команду. Позже в воскресенье команда встретилась с хозяином Баффало. Снова Bearcats забрали очки в парном разряде, на этот раз выиграв на 1-м и 3-м месте в парном разряде. Влоэдгрейвен, Леви и Джайн снова одержали победы на позициях 1, 2 и 4 в одиночном разряде. Второкурсник Гилберт Вонг также одержал победу над командой, одержав решающую победу со счетом 6: 1, 6: 1 в одиночном разряде № 3. В следующий раз Бингемтон примет UMBC и FDU 10 апреля. Женщины Bearcat одержали победу со счетом 4: 3 над UNC в Уилмингтоне 1 апреля. Бингемтон получил двойное очко, чтобы начать матч, с победами на 1-м и 3-м слотах. Юная Анна Эдельман (Грейт-Нек, Нью-Йорк / Грейт-Нек-Норт) набрала очко для команды, выиграв в одиночном разряде № 2, в то время как второкурсница Марина Быковская заработала еще одну прямую победу для Bearcats на шестой позиции. Затем UNC-Wilmington восстановился, одержав две победы в номинации No.1-е и 5-е места, но второкурсница Джиллиан Сантос (Флашинг, штат Нью-Йорк / Кардозо) завершила первый сет, выиграв 3-е место в одиночном разряде, завершив матч для Бингемтона. В следующий раз Bearcats проведут UMBC 10 апреля.

Boston U. – Женщины-терьеры в следующий раз сыграют в Массачусетсе 10 апреля, а мужчины – в субботу.

Хартфорд – Обе команды одержали свои первые победы в сезоне во вторник, каждая победив Вагнера со счетом 7: 0. Сегодня днем ​​(7 апреля) «Ястребы» играют в Holy Cross.

UMBC – После поражения со счетом 4: 2 от соперника конференции Стоуни Брука, мужчины UMBC пришли в норму и улучшились до 14: 4 в сезоне с победой над Коппин Стэйт со счетом 7: 0 3 апреля.Ретриверы отдохнули в одиночном разряде у постоянных клиентов Криса Мейера (Нью-Маркет, Мэриленд / Урбана), Фреди Вурмана (Таллинн, Эстония / Audentes Private) и Голтье Берре (Ланьи-сюр-Марн, Франция) в одиночном разряде, а старшего специалиста по парным парам Логана Брикера (Шенандоа, Вирджиния). Округ Пейдж), второкурсник Аллен Цанг (Уэллсли, Массачусетс / Американское наследие) и юниор Шейн Яп (Восточный Брансуик, Нью-Джерси / Восточный Брансуик) соревновались и выиграли в одиночном разряде. UMBC встретится с Бингемтоном в Вестале, штат Нью-Йорк, 10 апреля, в их единственном матче недели. У женщин-ретриверов результат улучшился до 12-5 в сезоне, когда 2 и 3 апреля местные соперницы Таусон и Коппин Стэйт проиграли дома (7-0).Старшая Барбара Коуту (Тересполис, Бразилия / Centrode Ensino Moderno) и первокурсница Лорена Валенте (Флорианополис, Бразилия / Коракао де Жезус) улучшили свои результаты в парном бою до 13: 2 в этом сезоне с победой над Тоусоном 8: 0. UMBC встретится с Бингемтоном в Вестале, штат Нью-Йорк, 10 апреля, в их единственном матче недели.

Стоуни-Брук – «Моряки» победили Джорджтаун 31 марта со счетом 5: 2. Стоуни Брук взял двойное очко с победами в двух первых местах. Затем команда одержала победу в одиночном разряде под номерами 1, 3, 5 и 6.Оба второкурсника Митч Вонг (Тампа, Флорида / Уортон) и Макс Стабхольц (Париж, Франция / Жан Вилер / Линденвуд) одержали близкие трехсетовые победы на позициях № 3 и 6, завершив матч за «Стоуни Брук». Следующий матч у мужчин состоится 10 апреля. Женщины также обыграли Джорджтаун в среду со счетом 6: 1. «Морские волки» взяли верх над двумя очками и перенесли свой импульс в одиночные игры. Команда проиграла только один одиночный матч, уступив 4-е место в трех сетах. Стоуни Брук возвращается в бой 11 апреля против New Jersey Tech.

Мария Быховская, кандидат неврологии

Повествовательная биография

Доктор Быховская – штатный профессор кафедры неврологии медицинского факультета Уэйнского государственного университета. Ее лаборатория обладает опытом в области клеточной, молекулярной и вычислительной нейробиологии, а исследовательская программа в лаборатории сосредоточена на фундаментальных механистических проблемах синаптической передачи.Ее доктор философии. обучение проходило в области вычислительной биофизики и молекулярного моделирования. Впоследствии она использовала постдока по нейробиологии, чтобы начать карьеру, посвященную изучению пресинаптических механизмов и пластичности. В качестве ИП она развивала в своей лаборатории знания в области электрофизиологии, конфокальной визуализации в реальном времени и электронной микроскопии, и эти экспериментальные подходы сочетаются с математическим и компьютерным моделированием. Исследования в лаборатории постоянно поддерживаются Национальным институтом здравоохранения и Национальным научным фондом.Она была членом экспертных комиссий в Национальном институте здравоохранения, Национальном научном фонде и Национальной академии наук.

Резюме исследования:
Наше исследование сосредоточено на молекулярном механизме, который контролирует высвобождение нейрональных передатчиков и нервных окончаний. Нейрональные передатчики упаковываются в синаптические везикулы и высвобождаются путем слияния везикул с нейрональной мембраной. Мы изучаем мобилизацию, стыковку и слияние синаптических пузырьков.Эти процессы очень динамичны и пластичны, и нарушения их регуляции могут вызывать серьезные неврологические расстройства, такие как эпилепсия, аутизм, болезни Альцгеймера и Хантингтона, а также умственную отсталость.
Мы используем генетически модифицированных мышей для исследования роли синапсина, связанного с везикулами. Поскольку дефицит синапсина вызывает эпилепсию на животных моделях и у людей, мы применяем методы генетики, электрофизиологии и молекулярной биологии, чтобы раскрыть молекулярные и клеточные пути, которые позволяют белкам синапсина контролировать возбудимость в нейронных сетях мозга.

Еще одно направление наших исследований касается фундаментальной проблемы структурной синаптической пластичности. Интенсивная нейронная активность может привести к структурным изменениям нейронных связей, и считается, что это явление лежит в основе процессов обучения и памяти. Мы используем нервно-мышечные соединения дрозофилы для изучения зависимых от активности модификаций нейронных связей, поскольку этот модельный организм предоставляет отличные возможности для создания генетически модифицированных животных и наблюдения за ростом и дифференцировкой нейронов в реальном времени.

Недавно мы сосредоточились на вопросе, как молекулярный аппарат слияния регулирует последние стадии слияния синаптических пузырьков с нейрональной мембраной. Мы объединяем молекулярное моделирование, генетику дрозофилы и электрофизиологию, стремясь разработать вычислительные инструменты, которые позволили бы нам манипулировать механизмом слияния с помощью целевого мутагенеза.

Выпускник

Ленинградский политехнический университет им. М.С. 1987 Биофизика

Институт эволюционной физиологии им. И.М. Сеченова к.э.н. 1992 Вычислительная биофизика

Должность Название

Профессор неврологии и анатомии

Стипендии

Постдок Университета Вирджинии, 1997 г., неврология

Публикации

(ВЫБРАННО)

1.Васин А., Сабева Н., Торрес С., Фан С., Бушонг Е. А., Эллисман М. Х., Быховская М. 2019. Два пути для зависимого от активности роста и дифференцировки синаптических бутонов у дрозофилы. eNeuro. 2019 6 (4). pii: ENEURO.0060-19.2019.

2. Матос Х., Квилес Р., Андраде Р., Быховская М. 2019. Рост и возбудимость нейронов гиппокампа с дефицитом синапсина II. Mol Cell Neurosci. 96: 25-34.

3. Быховская М. 2019. Моделирование молекулярной динамики комплекса SNARE. Методы Мол биол.1860: 3-13.

4. Фортул Н., Быховская М., Ягота А. 2018. Крупнозернистая модель застегивания SNARE из частично собранных состояний. J. Phys. Chem. 6; 122 (48): 10834-10840.

5. Сабева Н.С., Быховская М. 2017. Фотоконверсия ФМ1-43 и электронная микроскопия. Анализ
в нервно-мышечном соединении дрозофилы. Bio Protoc. pii: e2523.

6. Быховская М., Васин А. 2017. Электрофизиологический анализ синаптической передачи у Drosophila. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol.doi: 10. 1002 / wdev 277.

7. Васин А., Быховская М. 2017. Записи фокальных макропатчей синаптических токов от нервно-мышечного соединения личинок дрозофилы. J Vis Exp. DOI: 10,3791 / 56493.

8. Феличиано П., Х. Матос, Р. Андраде, М. Быховская. 2017. Синапсин II регуляция ГАМКергической синаптической передачи зависит от подтипа интернейрона. J. Neurosci. 15; 37 (7): 1757-1771.

9. Сабева Н., Чо. Р., Васин, А. Гонсалес, J.T. Литтлтон, М. Быховская.(2017) Мутанты комплексина обнаруживают частичную сегрегацию между путями рециклинга, которые управляют вызванной и спонтанной нейротрансмиссией. J Neurosci 3: 383-396.

10. Гуан З., Быховская М., Хоркера Р.А., Саттон РБ, Акбергенова Ю., Литтлтон Дж. (2017) Скрининг супрессоров синаптотагмина показывает, что связывание SNARE контролирует время и кооперативность Ca (2+) слияния везикул. Элиф. pii: e28409.

11. Михаэли Л., Готфрид И., Быховская М., Ашери У. (2017) Фосфатидилинозитол (4,5) -бисфосфат направляет белок B с двойным доменом C2 на плазматическую мембрану.Движение. 18: 825-39.

12. Васин А., Вольфсон Д., Литтлтон Дж. Т., Быховская М. (2016) Взаимодействие вспомогательной спирали комплексина с синаптобревином регулирует спонтанное слияние, Biophys J 111, 1954-1964.

13. Быховская М. 2015. Связывание кальция способствует конформационной гибкости нейронального синаптотагмина Ca2 + -сенсора. Биофиз. J. 108: 2507-20.

14. Fortoul, N., Singh P., Hui C.Y., Bykhovskaia M., and A. Jagota. 2015. Крупнозернистая модель комплекса ловушек определяет количество ловушек, необходимых для стыковки.Биофиз. J. 108: 2258-69.

15. Васин А., Л. Зуева, К. Торрез, Д. Вольфсон, Дж. Т. Литтлтон, М. Быховская. 2014. Синапсин регулирует зависимое от активности разрастание синаптических бутонов в нервно-мышечном соединении дрозофилы. J. Neurosci. 34: 10554: 63.

16. Феличиано П., Р. Андраде, М. Быховская. 2013. Synapsin II и Rab3a взаимодействуют в регуляции эпилептической и синаптической активности в области CA1 синапсов гиппокампа. J. Neurosci. 33: 18319-30.

17.Быховская М., Ягота А., Гонсалес А., Васин А., Яковлев Ю.Т. Литтлтон. 2013. Взаимодействие дополнительной спирали комплексина с С-концом комплекса SNARE: модель молекулярной динамики зажима слияния. Биофиз. J. 105: 679-90.

18. Быховская М. 2011. Синапсиновая регуляция организации пузырьков и функциональных пулов. Семин. Cell Dev. Биол. 22 (4): 387-92.

19. Акбергенова Ю., Быховская М. 2009. Формирование резервного пула пузырьков в моторных бутонах дрозофилы под действием стимуляции.J Neurophysiol 101: 2423-2433.

20. Coleman WL, Bill CA, Simsek-Duran F, Lonart G, Samigullin D, Bykhovskaia M. 2008. Синапсин II и кальций регулируют стыковку пузырьков и перекрестные помехи между пулами пузырьков на моторных окончаниях мыши. J. Physiol 586: 4649-4673.

← Вернуться к списку

почетных вице-президентов

Почетных вице-президентов и членов Правления


Селезнев Лев Николаевич

До 2018 года был президентом Всероссийской федерации спорта лиц с ограниченными физическими возможностями, мастером спорта СССР, заслуженным тренером Российской Федерации, заслуженным работником физкультуры и спорта (с 1998 года).

Родился 27 сентября 1937 года в Подмосковье.

Образование

В 1961 году окончил Московский областной педагогический институт имени Н.К. Крупской, факультет физического воспитания. Специальность по диплому – учитель физического воспитания, тренер, учитель анатомии и физиологии. По специальности – учитель физкультуры, учитель анатомии и физиологии.

Профессиональный стаж

  • С 1992 года работает в паралимпийской сборной.

  • С 1961 по 1963 год – учитель физкультуры Быковской одиннадцатилетней школы (Сахалинская область, муниципальный район Долинск, село Быков).

  • С 1963 по 1964 год – инструктор физкультуры, преподаватель физкультуры ГПТУ №15 (Московская область).

  • С 1964 по 1975 год – Лев Селезнев был тренером-инструктором ДЮСШ №2 Воскресенского городского управления народного образования (г. Воскресенск Московской области).

  • С 1975 по 1978 год – главный тренер по легкой атлетике, заместитель председателя Московского областного совета Всесоюзного добровольного спортивного общества «Производственные стажеры» (г. Воскресенск Московской области).

  • С 1978 по 1987 гг. – тренер сборной команды СССР по легкой атлетике Московской области Комитета по физической культуре и спорту при Московском облисполкоме (г. Воскресенск Московской области).

  • С 1987 по 1991 год – тренер-инспектор Лев Селезнев, главный специалист отдела летних видов спорта Управления спортивного резерва Госкомитета СССР.

  • С 1991 по 1995 год – заместитель председателя правления Всероссийского республиканского оздоровительно-спортивного клуба инвалидов.

  • С 1995 по 1997 год – ведущий специалист, главный специалист отдела социальной реабилитации Центрального правления Всероссийского общества инвалидов.

  • С 1997 по 2002 год – Лев Селезнев был ведущим специалистом отдела физического воспитания, главным специалистом отдела оздоровления и оздоровительной работы с людьми с ограниченными возможностями, заведующим отделом оздоровления и физической реабилитации отдела развития физической культуры г. Государственный комитет Российской Федерации по физической культуре и спорту.

  • С 1999 по 2018 год – стал соучредителем и в настоящее время является почетным президентом Всероссийской федерации спорта лиц с ограниченными физическими возможностями.

  • С 2002 по 2006 год – Лев Селезнев был начальником отдела научно-методического обеспечения и аналитической работы, главным тренером сборной России по легкой атлетике ФГУ «Центр спортивной подготовки сборных команд России».

  • С 2006 по 2011 год – главный тренер Паралимпийской сборной, начальник спортивно-методического управления.

  • С 2006 года – советник руководителя аппарата Паралимпийского комитета.

Награды

Награжден медалью ордена «За заслуги перед Отечеством» первой степени (2014 г.), Орденом Дружбы (2002 г.), Почетной грамотой Президента Российской Федерации (2011 г.), Благодарностью Президента Российской Федерации ( 2010 г. ), памятная медаль «XXII Олимпийские зимние игры и XI Паралимпийские зимние игры 2014 г. в Сочи» и Почетная грамота Президента Российской Федерации (2014 г.), Почетный знак «Патриот России» (2016 г.), Благодарность Президент Паралимпийского комитета России «За высокий уровень организации подготовки и участия спортивной команды России в XI Паралимпийских зимних играх 2014 года в Сочи» (2014 г.), Благодарность «За активную работу по подготовке и проведению Всемирные игры Международной федерации спорта инвалидов и инвалидов (IWAS) »(2015), медали« За освоение целинных земель »и« За мужество в огне », медаль« 15 лет Паралимпийскому комитету России », Юбилейный знак. «20 лет уши Паралимпийского комитета России »(2016).

Женат, имеет двоих сыновей и внучку.


Тарабыкин Аксандр Викторович

Родился 29 апреля 1955 года в городе Новосибирске в семье служащего. По окончании института поступил на отделение физической культуры Тюменского пединститута (1971–1974). Затем начал заниматься спортом, начав работу детским тренером в областной спортивной школе.

С 1975 по 1977 год служил в спортивных частях воинских частей Советской Армии.Мастер спорта СССР.

С 1977 по 1982 год – занимаясь спортом и занимаясь спортом, окончил факультет физического воспитания Курганского пединститута. Педагог ДЮСШ города Тюмени.

Более 20 лет (с 1971-1994 гг.) Занимался физическим воспитанием молодежи и подготовкой спецконтингента к службе в рядах ВС РФ и ВМФ.

С 1985 по 1986 год – продолжил профессиональную деятельность директором спортивного комплекса Винзилинского домостроительного комбината в Тюмени. Затем – как директор турбазы, руководитель пионерлагеря Главтюменнефтегазстрой.

С 1986 по 1989 годы – директор спортивного комплекса «СибНИПИгазстрой».

С 1989 по 1990 год – заместитель управляющего треста «Обсантехмонтаж».

С 1990 года создал и наладил работу ряда предприятий для инвалидов: оздоровительного кооператива «Здоровье», производственного кооператива «Развитие», Всероссийской благотворительной федерации спорта инвалидов, ЗАО «Фирма Олимп-5», Паралимпийский комитет Тюменской области. На этих предприятиях инвалиды реабилитировались средствами физического воспитания и спорта, получили профессии и рабочие места.

В 1995 году в городе Тобольске Тюменской области Александр Тарабыкин выступил с инициативой развития паралимпийского движения в России, став одним из основателей «Паралимпийского комитета России». С этого момента он активно работает вице-президентом Паралимпийского комитета России.

В 1998 году он был избран президентом Российского комитета Всемирных юношеских игр и вице-президентом Международного комитета Всемирных юношеских игр.

Тарабыкин Александр Викторович более 15 лет ведет направленную работу по адаптации инвалидов и их интеграции в общественную жизнь.

Под его руководством было проведено 8 чемпионатов России среди спортсменов с ограниченными физическими возможностями.

В результате его деятельности Тюменская область по праву стала крупнейшим центром международного спорта, значительно расширив международные связи спортсменов-инвалидов России.

В 1996 году в Тюмени прошел Всемирный зимний культурно-спортивный фестиваль спортсменов-инвалидов с участием 17 стран ближнего и дальнего зарубежья.

В том же году Александр Викторович организовал Международный конгресс по проблемам социальной, медицинской и психолого-педагогической реабилитации инвалидов.

В 1997 году в Тобольске прошел чемпионат Европы среди спортсменов-инвалидов по лыжным гонкам и биатлону. Сборная России выиграла и завоевала 21 золотую, 21 серебряную и 21 бронзовую медаль.

В ноябре 1997 года баллотировался на должность вице-президента Международного паралимпийского комитета в Сиднее (Австралия).

В 1998 году он был избран председателем Международной федерации спорта для слепых (IBSA) Азиатского континента.

В 1998 году Тюменская область стала основной базой подготовки спортсменов-инвалидов к Паралимпийским зимним играм в Нагано, Япония. Результат выступления сборной России – 3 командных места и 12 золотых медалей, 8 из которых завоевали спортсмены-инвалиды из Тюменской области, подготовленные А. В. Тарабыкин, Б.А. Мишатин, В. Гольдинов.

С 2001 г. – доцент кафедры реабилитации, спортивной медицины и физической культуры с курсом физиотерапии и спортивной медицины факультета усовершенствования врачей РГМУ, г. Москва. Имеет научные статьи и публикации (более 20), разработки и комплексные программы по развитию физического воспитания в Российской Федерации.

С 2001 по 2004 – 2001 – 2004 гг. – директор учебно-спортивного комплекса Российского государственного медицинского университета.

В 2006 году был переизбран вице-президентом Паралимпийского комитета России.

Заслуги и почести

Приказом № 176-р от 28 ноября 1996 г. награжден Почетной грамотой Правительства Российской Федерации за большой личный вклад в решение проблем социальной интеграции людей с ограниченными возможностями здоровья в общество.

За достижения в развитии физической культуры и спорта паралимпийского движения в России награжден Государственными премиями:

Указом Президента Российской Федерации от 26 июля 1994 г. присвоено почетное звание «Заслуженный деятель физической культуры Российской Федерации».

Указом Президента РФ от 4 марта 1998 г. награжден Орденом Дружбы.

1 октября 1998 года Председателем Государственного комитета Российской Федерации по физической культуре и туризму присвоено почетное звание «Заслуженный тренер России».

Награжден медалями:

«300 лет Российскому флоту»

«Для укрепления военной общественности»

«За воинскую доблесть»

«200 лет Министерству обороны»

«300 лет Балтийскому флоту»


Царик Анатолий Владимирович

Образование

Высшее образование. Окончил Гомельский педагогический университет имени В.П. Чкалова, Академия общественных наук (с отличием) и Академия народного хозяйства СССР.

Профессиональный стаж

С сентября по ноябрь 1961 года работал учителем физкультуры в Мозырской средней общеобразовательной школе № 4 Белорусской ССР.

С 1963 по 1964 год – инструктор областного совета добровольного спортивного общества «Минский областной совет».

С 1964 по 1965 год – Анатолий Царик был старшим тренером Совета Союза спортивных обществ и организаций Белорусской ССР.

С 1965 по 1969 год – заведующий отделением отдела физического воспитания студентов Совета Союза спортивных обществ и организаций Белорусской ССР.

С 1969 по 1973 год – заведующий отделом спортивных федераций Совета Союза спортивных обществ и организаций Белорусской ССР.

С 1973 по 1980 год – заведующий отделом водных видов спорта Комитета по физической культуре и спорту при Совете Министров СССР.

С 1980 по 1981 год – главный тренер и методист Инспекции по контролю за исполнением постановлений партии и правительства, а также решений Спорткомитета СССР.

С 1981 по 1986 год – Анатолий Царик был председателем Центрального совета ДСО «Локомотив».

С 1986 по 1992 год – начальник Главного управления физической культуры населения Госкомитета СССР по физической культуре и спорту.

С 1992 по 1996 год – президент Всероссийской ассоциации физической культуры и спорта для всех.

С 1996 по 1997 год – заместитель директора Всероссийского научно-исследовательского института физической культуры и спорта.

С 1997 по 1998 год – Анатолий Царик возглавлял Центр региональных проблем физической культуры и спорта Всероссийского научно-исследовательского института физической культуры и спорта.

С 1998 по 1999 год – заведующий отделом физкультурно-спортивной работы с людьми с ограниченными возможностями Департамента здравоохранения и отдыха, а также по связям с государственными и общественными организациями Госкомитета Российской Федерации по физической культуре и туризму.

С 1999 по 2000 год – Анатолий Царик был начальником отдела физкультуры и спортивных школ Департамента физической культуры и спорта Министерства физической культуры, спорта и туризма Российской Федерации.

С 2000 г. – вице-президент Паралимпийского комитета России.

С 2000 по 2002 год – заместитель начальника Департамента развития физической культуры Министерства Российской Федерации по физической культуре, спорту и туризму.

С апреля по июнь 2002 г. – проректор Академии Наций (Москва).

С 2004 по 2010 год – национальный тренер по паралимпийским видам спорта ФГУ «Центр спортивной подготовки сборных команд России».

В 2010 году был главным тренером сборной России по легкой атлетике в Центре спортивной подготовки сборных команд России.

С февраля 2010 г. по настоящее время – Анатолий Царик является заместителем начальника отдела паралимпийских, сурдлимпийских и неолимпийских видов спорта Центра спортивной подготовки сборных команд России ФГБУ.

Почести

Лауреат конкурса Всесоюзного общества «Знание» за авторскую книгу «О физической и духовной культуре», автор-составитель книг «Физическая реабилитация и спорт инвалидов», «Справочник работника физической культуры и спорта». (четыре издания), «Сборник уставов и положений по паралимпийским видам спорта» (два издания) и книга «Паралимпийские виды спорта», автор книги «Культура тела и духа» и брошюры «Физическое воспитание населения и массовые виды спорта». в Японии », ряд других книг и брошюр, а также более 150 научных и научно-практических статей.

Награжден Орденом Почета (2010 г.), Почетной грамотой Президента Российской Федерации (2013 г.), Почетной грамотой Президента Российской Федерации (2011 г.), памятной медалью «XXII Зимние Олимпийские игры и Олимпийские игры. XI Паралимпийские зимние игры 2014 г. в Сочи »и письмо Президента Российской Федерации (2014 г.), Орден Дружбы народов (1986 г.), Благодарность Президента Паралимпийского комитета России« За высокий уровень организации подготовка и участие спортивной команды России в XIV Паралимпийских летних играх 2012 г. в Лондоне »(2012 г.), Благодарность Президента Паралимпийского комитета России« За высокий уровень организации подготовки и участие спортивной команды России в XI. Паралимпийские зимние игры 2014 г. в Сочи »(2014 г.), Благодарность« За активную работу по подготовке и проведению Всемирных игр Международной федерации спорта инвалидов-колясочников и ампутантов (IWAS) »( 2015), медаль «15 лет Паралимпийскому комитету России», юбилейный знак «20 лет Паралимпийскому комитету России» (2016).

РАЗВИТИЕ АРХИТЕКТУРЫ УЧРЕЖДЕНИЯ НЕФОРМАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ В ПЕРИОД С КОНЕЦ 19 – НАЧАЛО 20 ВЕКА p r z e s t r z e ń i FORMa ‘37_2019

ty среди населения, общественных организаций и обществ, частных лиц и т.д., и название журнала

стало их своеобразным лозунгом.Функции таких первых из

школьных учреждений носили в основном компенсационный характер: классы в этих учреждениях компенсировались

из-за отсутствия учебы детей. Деятельность педагогов по организации

жизни детей с учетом социально-экономической деятельности того времени носила

характер конкретно-практической направленности воспитания и небольшую исключительную педагогическую ценность для детей

. развитие народного образования.Прогрессивные энтузиасты работали с

создания образовательных клубов для детей, летних лагерей за счет средств местных педагогических

обществ. Такая образовательная деятельность легла в основу системы, которая впоследствии получила название «внешкольное образование» [7].

Организованная как концепция детская внешкольная организация, датируется, согласно

различным источникам, 1878–87 годами и связана с именами американцев

Томас Шеу и Стэнтон Койт [5,14 , 10,1].

В конце 19 века общество искало решения проблемы бездомных детей

детей, наводнивших улицы многих городов мира. В основном это были дети

рабочих, ремесленников и городской бедноты, родители которых были заняты обеспечением продуктами питания. Без надлежащего надзора со стороны взрослых

они подвергались негативному воздействию улицы,

подвергались риску и часто становились свидетелями преступлений.

В Америке возникло движение, объединившее под своим флагом всевозможные кружки, союзы,

общества, поставившие перед собой цель заботиться о моральном и физическом благополучии

бездомных детей городских домов. Первый американский клуб – Settlement был основан

доктором Стэнтоном Койтом в 1887 году в Нью-Йорке. Шесть местных мальчиков составили первоначальное членство

Coit’s Lily Pleasure Club. Девиз клуба: «Порядок – наша основа; улучшение нашей цели

; дружба – наш принцип ». Они встречались дважды в неделю, платя еженедельный членский взнос в размере

10 центов. Четверть выручки пошла на помощь больным и бедным в районе

Нижний Ист-Сайд; Также были внесены вклады в поддержание чистоты на улице.Мероприятия клуба

включали экскурсии, отдых, занятия по резьбе по дереву и лепке из глины, а также дискуссии

по социальным вопросам дня, например:

«Принято решение: девушкам младше 18 лет не разрешается работать на фабриках. ” [5,14].

В 1889 году появились два поселения, основанные прогрессивными женщинами, окончившими

американских университетов. Благотворное влияние Поселений не заставило себя долго ждать, и

почувствовали себя очень скоро. Поселки дают каждому, независимо от возраста, кров и

удовлетворения на основе их инициативы и взаимопомощи. «Поселения»

не признавали порабощения личности, а, скорее, широко ее развили –

лет. Во всей Англии и Америке Поселения превратились в целые маленькие городки

, где дети составляли две трети людей, приезжавших в них. Элементами

услуг для детей являются ясли, детские сады и клубы для детей и взрослых, ли-

брари, читальные залы, спортзалы, бассейны, душевые, дешевые спальни для

беспризорников.Дешевая распродажа вещей, для собственных клиентов, мастерские, вечерние

занятий и курсов, дешевые столовые, сберкассы, копейка для детей, популярные

концертов, лекций, экскурсий, летняя колония и многое другое [1].

Одним из самых популярных примеров подражания был клуб Томаса Шеу в Америке.

Томас Шеу, сын бедного рабочего, с 12 лет работал в ткацком цехе

, отдавая свободное время беспризорным детям. Он постоянно был окружен ими

и пользовался у них большой популярностью. В 1890 году Томас Шу собрал детей в

своей тесной комнате, обучал и развлекал их различными играми. Услышав о нем

, он собрал все больше и больше толпы мальчиков, и в результате спонтанно возник клуб

, для которого требовалось больше места. Владелец фабрики увидел положительное влияние

Шеу на детей и построил клубный дом. Членами клуба стали до 2000 уличных мальчиков от 8 до 12 лет

.Клуб руководствовался самоуправлением, имел

выборных советов по обязательному подчинению своим решением.

Межфазные явления и теплопередача

Международный симпозиум и школа молодых ученых

Межфазные явления и теплопередача

прошла в Институте теплофизики им. Кутателадзе СО РАН.
Академгородок, Новосибирск, Россия
, 2-4 марта 2016 г.

Список сессий симпозиума и соответствующих победителей премии «Лучший плакат»:

Сессия – 1: Кипячение в бассейне: CHF, распространение сухих пятен, кризы кипения, эффекты линии контакта.
Дмитрий Зайцев, Дмитрий Кириченко, Олег Кабов «Динамика кластеров микрокапель в нагретом слое жидкости при образовании сухих пятен».

Сессия 2: Кипение в потоке, пленки под действием сдвига: CHF, нано- и микроструктурированные поверхности, волновая структура, сухие пятна.
Мария К. Влаху, Джон С. Лиумбас, Константин Давид, Тодорис Д. Карапанциос «Переохлажденный поток, кипящий в прямоугольном макроканале при высоких массовых расходах: характеристики горизонтальной и вертикальной ориентации».

Сессия-3: Смачивание, супергидрофобные поверхности, испарение капель, сложные жидкости.
Александр Дубов, Ольга Виноградова «Гистерезис краевого угла и переход смачивания на супергидрофобных полосатых поверхностях».

Сессия-4: Термокапиллярные потоки: нестабильность, испарение, газовый поток и гравитационные эффекты.
Хатим Махрафи, Пьер К. Доби «Конвективные тепловые структуры и поток испарения через испаряющуюся поверхность: параметрическое исследование».

Сессия 5: Потоки в микроканалах и миниканалах: уменьшение сопротивления, двухфазные модели потока, эффекты смачиваемости.
Вьяс Сринивасан, Самир Хандекар «Математическое моделирование движения изолированной жидкой пробки внутри сухой капиллярной трубки»

Сессия 6: Явления межфазных и фазовых изменений.
Михаил В.Тимошевский, Иван Иванович Запрягаев, Константин Сергеевич Первунин, Дмитрий М. Маркович «Кавитирующее управление потоком посредством непрерывного тангенциального нагнетания массы»

Скачать программу симпозиума и сборник тезисов. (~ 22 МБ)

Стулья для симпозиумов

Владимир Сергеевич Аджаев
Южный методистский университет, факультет математики, Даллас, Техас, США

Алексеенко Сергей Владимирович
Институт теплофизики им. Кутателадзе СО РАН, Новосибирск, Россия

Олег А.Кабов
Институт теплофизики им. Кутателадзе СО РАН, Новосибирск, Россия

Харухико Охта
Университет Кюсю, кафедра аэронавтики и астронавтики, Фукуока, Япония

Ученые секретари: Быковская Елена Федоровна, Зайцев Дмитрий Федорович, Институт теплофизики им. Кутателадзе СО РАН

Организаторы симпозиума

  • Институт теплофизики им. Кутателадзе СО РАН, Новосибирск, Россия
  • Университет Кюсю, Ниси-ку, Фукуока, Япония
  • Южный методистский университет, Даллас, Техас, США
  • Begell House, Inc., Данбери, Коннектикут, США

Спонсор

Российский научный фонд
Проект N 15-19-30038 «Межфазные явления в сложных микромасштабных двухфазных потоках»

Цель

Симпозиум призван предоставить исследователям платформу для обмена информацией и определения потребностей в исследованиях в междисциплинарной, быстро развивающейся области исследований межфазных явлений, охватывающей несколько дисциплин, включая химическую инженерию, машиностроение, прикладную математику, физику и химию.Темы для обсуждения будут включать пять научных направлений:

  • Кипячение в бассейне: CHF, распространение сухих пятен, кризисы кипения, эффекты линии разграничения
  • Кипение в потоке, пленки под действием сдвига: CHF, нано- и микроструктурированные поверхности, волновая структура, сухие пятна
  • Смачивание, супергидрофобные поверхности, испарение капель, сложные жидкости
  • Термокапиллярные потоки: нестабильность, испарение, газовый поток и гравитационные эффекты.
  • Потоки в микроканалах и миниканалах: уменьшение сопротивления, двухфазные структуры потока, эффекты смачиваемости
  • Явления межфазных и фазовых изменений

Загрузить первое объявление

CD8 + Т-клетки человека управляют ответами Th2 посредством дифференцировки дендритных клеток, продуцирующих TNF / iNOS – Чонг – 2011 – Европейский журнал иммунологии

Введение

DC соединяют врожденный и адаптивный иммунитет путем включения сигналов от факторов окружающей среды, чтобы управлять активацией Т-клеток 1.В то время как ДК демонстрируют дендритную форму и проявляют функции ДК во время устойчивого состояния, воспалительные ДК, происходящие из моноцитов CCR2 + , появляются только в результате инфекции или воспаления 2. Недавние исследования на мышах выявили подмножество воспалительных ДК, известных как TNF / iNOS-продуцирующие DC (Tip-DC), которые важны для клиренса бактерий Listeria monocytogenes 3; вирус гриппа 4; и регуляция продукции IgA в слизистых оболочках иммунитета 5. Поскольку дифференцировка моноцитов в DCs или макрофаги зависит от микроокружения, присутствие различных типов T-клеток и цитокинов является критическим признаком в определении результата дифференцировки 6.

Помимо своей цитотоксической функции 7, CD8 + Т-клетки, как было показано, регулируют аллергические заболевания, подавляя развитие Th3-ответов 8, 9 и управляя Th2-иммунитетом при микробных инфекциях 10-12. CD8 + Т-клетки оказывают это влияние на про-Th2 посредством механизма обратной связи во время их взаимодействия с DC. CD8 + Т-клетки используют множество факторов, включая IFN-γ, GM-CSF, TNF-α и CD40L, для активации DC для продукции IL-12p70 8, 13, 14, ключевого цитокина Th2 иммунитета 15.Важно отметить, что CD8 + T-клетки, как было показано, взаимодействуют с DC как в лимфатических узлах 16, так и в участках периферической ткани 4, 17, где они проявляют свое влияние pro-Th2.

Предыдущие исследования показали, что CD8 + Т-клетки способны быстро проникать в воспаленные участки 18, что может способствовать их раннему взаимодействию с DC. В исследованиях псориаза у людей введение алефасепта, который снижает инфильтрацию активированных Т-клеток памяти CD8 + , снижает содержание ДК, воспаление и тканевую экспрессию iNOS и IFN-γ 19.Эти данные предполагают, что Т-клетки CD8 + могут влиять на дифференцировку и функцию DC для поддержания ответов Th2. Однако остается неизвестным, вносят ли CD8 + Т-клетки вклад в дифференцировку Tip-DC и обладают ли Tip-DC способностью поддерживать Т-клетки, продуцирующие IFN-γ.

В этом исследовании мы демонстрируем, что CD8 + Т-клетки могут индуцировать быстрое развитие человеческих моноцитов в Tip-DC, которые способны дополнительно управлять Th2-ответами путем праймирования наивных CD4 + Т-клеток.Взятые вместе, наши результаты идентифицируют ранее не описанную функцию Т-клеток CD8 + , которая может помочь объяснить их роль в иммунитете Th2 и воспалении.

Результаты

Активированные CD8

+ Т-клетки индуцируют ответы Th2 путем примирования DC для продукции IL-12p70

Для исследования механизмов, с помощью которых Т-клетки CD8 + поддерживают иммунные ответы Th2, мы создали модель человека in vitro, где Т-клетки CD8 + совместно культивировали с DC, как описано ранее 13. Активированные аллогенные Т-клетки CD8 + , экспрессирующие как IFN-γ, так и перфорин (фиг. 1A), индуцировали повышенную регуляцию CD40, CD80, CD83 и CD86 на DC через 18 ч совместного культивирования (фиг. 1B). Напротив, свежевыделенные CD8 + Т-клетки увеличивали экспрессию костимулирующих молекул DC в меньшей степени. CD40L не был обнаружен на Т-клетках CD8 + (данные не показаны), что позволяет предположить, что, в отличие от мышей 13, CD40L не играет роли в перекрестном взаимодействии CD8 + Т-клетки-DC человека.Не было обнаружено значительного снижения жизнеспособности DC в совместных культурах с активированными CD8 + T-клетками, что указывает на то, что CD8 + T-клетки не убивали DC в этих экспериментах (рис. 1C). Затем мы исследовали способность CD8 + Т-клеток примировать DC для продукции IL-12. Учитывая, что для эффективного производства IL-12p70 требуется по крайней мере два активирующих сигнала 20, мы добавили липополисахарид (ЛПС) в качестве дополнительного стимула. ДК, активированные IFN-γ и LPS, использовали в качестве положительного контроля.В отличие от свежевыделенных CD8 + T-клеток, которые не смогли индуцировать какой-либо IL-12p70, активированные CD8 + T-клетки стимулировали DC для продукции устойчивых количеств IL-12p70 в присутствии LPS (рис. 1D).

Активированные CD8 + Т-клетки индуцируют созревание ДК и продукцию IL-12p70. (A) Свежевыделенные или активированные Т-клетки CD8 + стимулировали анти-CD3 / 28 вместе с Golgi Stop в течение 6 часов и окрашивали на внутриклеточный IFN-γ и перфорин.Числа представляют собой процент положительных ячеек. (B – D) Незрелые DC культивировали со свежевыделенными или активированными аллогенными CD8 + Т-клетками в течение 18 часов. (B) Клетки окрашивали на маркеры созревания DC с использованием FACS. Жирные числа слева указывают на среднюю интенсивность флуоресценции (MFI), а числа справа обозначают процент положительных клеток. (C) Клетки собирали и DC определяли экспрессию MHC класса II. График показывает процент жизнеспособных ДК, оцененных с помощью FACS для аннексин-V и 7-AAD отрицательных клеток.Данные (среднее + стандартное отклонение) являются репрезентативными для трех независимых экспериментов. Статистической значимости DC-киллинга не наблюдалось среди групп, использующих однофакторный дисперсионный анализ (D). IL-12p70 анализировали с помощью ELISA в трех повторностях. ** p <0,005 с использованием двустороннего непарного критерия Стьюдента t . (nd, не обнаружено) (E и F) CD8 + Т-лимфоциты (CTL), специфичные для пептида Flu M1 (вставка: процент клеток, положительных по тетрамеру M1 гриппа), совместно культивировали с (E) аутологичными незрелыми DCs с или без 5 мкМ пептида или LPS, где указано, или (F) с увеличивающимися дозами пептида.IL-12p70 анализировали с помощью ELISA в трех повторностях. ** p <0,005 с использованием двустороннего непарного критерия Стьюдента t . Результаты (среднее ± стандартное отклонение) являются представителями пяти независимых экспериментов со сравнимыми результатами.

Чтобы продемонстрировать способность CD8 + T-клеток индуцировать продукцию IL-12p70 DC антиген-специфическим образом, мы создали CD8 + T-клеточные линии (CTL), специфичные для пептида M1 гриппа.Грипп-специфические CTL (специфичность 85,7% для тетрамера M1; фиг. 1E, вставка), культивированные с аутологичными DC в отсутствие пептида, с или без LPS, не смогли секретировать какой-либо IL-12p70 (фиг. 1E). В соответствии с нашими выводами с аллогенными культурами (рис. 1D), CTL, культивированные с нагруженными пептидом DC в присутствии LPS, продуцировали IL-12p70, а CTL в отсутствие LPS – нет (рис. 1E). Продукция IL-12p70 увеличивалась дозозависимым образом при использовании концентрации пептида Flu M1 (фиг. 1F). Эти данные дополнительно подтверждают роль активированных CD8 + Т-клеток в примировании DCs для IL-12p70 13,14.

CD8

+ Взаимодействие Т-клетки с ДК приводит к продукции провоспалительных цитокинов и хемокинов

Затем мы исследовали, приводит ли взаимодействие активированных Т-клеток CD8 + с DC к продукции цитокинов или хемокинов, которые способствуют ответам Th2. ДК, стимулированные LPS, продуцируют GM-CSF, IFN-γ, IL-6, IL-10 и TNF-α (вспомогательная информационная таблица 1A), а также MCP-1, MIP-1α и β, RANTES и IP-10 (вспомогательная информация, таблица 1A). Информационная таблица 2A).Напротив, активированные CD8 + Т-клетки, повторно стимулированные анти-CD3 / CD28, продуцировали GM-CSF, IFN-γ, TNF-α (вспомогательная информационная таблица 1B), MIP-1α и β и RANTES (вспомогательная информационная таблица 2B). ). Когда активированные CD8 + Т-клетки культивировали с DC, GM-CSF, IFN-γ, TNF-α, MCP-1, MIP-1α и β, продукция RANTES и IP-10 увеличивалась, а IFN-γ, TNF- α, MIP-1α и β, RANTES и IP-10 были дополнительно улучшены в присутствии LPS (вспомогательные информационные таблицы 1B и 2B). Внутриклеточное окрашивание совместно культивируемых клеток также показало, что IFN-γ, GM-CSF и TNF-α экспрессируются как Т-клетками CD8 + , так и DC, хотя IFN-γ в основном экспрессируется Т-клетками CD8 + , в то время как GM -CSF и TNF-α в основном экспрессировались DC (вспомогательная информация, рис.S1). Профили цитокинов и хемокинов были сходными для гриппоспецифичных CTL, при этом CTL совместно культивировались с нагруженными пептидом DC и LPS, секретирующими наибольшие количества (вспомогательные информационные таблицы 1C и 2C). В культурах не было обнаружено ИЛ-4 и ИЛ-23. Эти данные предполагают, что взаимодействия CD8-DC приводят к продукции воспалительных цитокинов и хемокинов, которые могут усиливать набор и дифференциацию других иммунных эффекторов.

Моноциты, подвергшиеся действию CD8

+ Среда цитокинов Т-лимфоциты-ДК демонстрирует характеристики постоянного тока

Поскольку моноциты являются важными предшественниками ДК и макрофагов 21, мы исследовали, изменяет ли цитокиновая среда, порожденная взаимодействиями CD8 + Т-клетки-ДК, морфологию моноцитов. Моноциты, культивированные с супернатантами DC или DCLPS (Supernatant DC или DCLPS ), демонстрируют морфологию, аналогичную моноцитам, которые культивировались только с средой (фиг. 2A). Напротив, моноциты, подвергшиеся воздействию супернатантов CD8DC или CD8DCLPS (супернатант CD8DC или CD8DCLPS ), развивали длинные веретенообразные дендриты и, хотя и меньше по размеру, похожи на зрелые классические DC, полученные из IL-4 / GM-CSF (рис. 2B). . Они также четко отличались от макрофагов, у которых вместо них были вакуоли (рис.2Б).

Моноциты, подвергшиеся воздействию цитокиновой среды CD8-DC, дифференцируются в клетки с различными морфологиями, которые напоминают классические зрелые DC. (A) Моноциты культивировали только с культуральной средой (без цитокинов) или супернатантами, собранными из культур только DC, DC + LPS, CD8 + DC или CD8 + DC + LPS в течение 48 часов. (B) Классические DC и макрофаги были получены из моноцитов в присутствии IL-4 / GM-CSF и M-CSF соответственно в течение 6 дней. ЛПС добавляли еще на 24 часа, чтобы вызвать их созревание. Клетки окрашивали гематоксилином и эозином (H&E) и фиксировали с помощью микроскопа Leica DM2000 (Leica Microsystems, Сингапур). Первоначальное увеличение было × 630 для всех панелей (шкала: 15 мкм). Показанные данные являются представителями шести экспериментов.

Мы дополнительно проанализировали фенотип этих клеток с помощью проточной цитометрии. ДК IL-4 / GM-CSF экспрессировали высокие уровни MHC класса I, HLA-DR, CD40, CD80, CD86 и DC-SIGN (рис.3А). Точно так же моноциты, подвергшиеся воздействию супернатанта CD8DC или CD8DCLPS , напоминали DC по экспрессии высоких уровней MHC класса I, HLA-DR и CD40 и умеренной экспрессии CD80, CD86 и DC-SIGN (фиг. 3A). За исключением CD14, экспрессия этих поверхностных молекул на моноцитах, подвергшихся воздействию супернатанта CD8DC или CD8DCLPS , была также выше, чем на макрофагах и моноцитах, полученных из M-CSF, подвергшихся воздействию супернатанта DC или DCLPS (фиг. 3A). И ДК IL-4 / GM-CSF, и макрофаги M-CSF экспрессировали низкие уровни CCR1, CCR2 и промежуточные уровни CX3CR1 (рис.3Б). ДК IL-4 / GM-CSF активировали CCR7, а макрофаги M-CSF активировали CCR5 (фиг. 3B). Напротив, моноциты, подвергшиеся воздействию супернатанта CD8DC или CD8DCLPS , имели более высокие уровни CCR1, CCR2, CX3CR1 и аналогичные уровни CCR5, чем DC IL-4 / GM-CSF. Моноциты, подвергшиеся воздействию супернатанта DC или DCLPS , напоминали макрофаги M-CSF за счет более высокой экспрессии CCR5 и не имели повышающей регуляции CCR7 (фиг. 3B). Экспрессия TLR2, TLR4 и TLR8 также была выше на моноцитах, подвергшихся воздействию супернатанта CD8DC или CD8DCLPS , по сравнению с необработанными моноцитами или моноцитами, подвергшимися воздействию супернатанта DC или DCLPS (рис.3Б). Примечательно, что экспрессия TLR3 ограничивалась только DC IL-4 / GM-CSF и моноцитами, подвергшимися воздействию супернатанта CD8DC или CD8DCLPS (фиг. 3B). Наконец, только моноциты, подвергшиеся воздействию супернатанта CD8DC или CD8DCLPS , экспрессировали классический маркер созревания DC CD83 и аналогично DCs IL-4 / GM-CSF (фиг. 3C). В целом, эти результаты предполагают, что моноциты, подвергшиеся воздействию супернатанта CD8DC или CD8DCLPS , очень напоминали DC IL-4 / GM-CSF.

Моноциты, подвергшиеся воздействию цитокиновой среды CD8-DC, отображают поверхностные маркеры DC.(A) Антигены клеточной поверхности, (B) хемокины и toll-подобные рецепторы зрелых IL-4 / GM-CSF DC, зрелые макрофаги M-CSF или моноциты, дифференцированные указанными супернатантами, анализировали с помощью FACS. (C) Экспрессию CD83 на клетках анализировали после дополнительной 24-часовой стимуляции LPS. Гистограммы показывают экспрессию поверхностных антигенов (сплошная линия) по сравнению с изотипическим контролем (линия). Цифры указывают на относительную разницу в MFI между экспрессией поверхностного антигена и контролем изотипа. Результаты являются представителями пяти независимых экспериментов с сопоставимыми результатами.

Моноциты, подвергшиеся воздействию CD8

+ Среда цитокинов Т-клетки-DC дифференцируются в клетки, похожие на Tip-DC

Затем мы исследовали, экспрессируют ли моноциты, подвергшиеся воздействию супернатанта CD8DC или CD8DCLPS провоспалительные медиаторы, такие как TNF-α и iNOS. Моноциты, подвергшиеся воздействию супернатанта CD8DC или CD8DCLPS , экспрессировали такие же уровни iNOS, что и макрофаги M-CSF (фиг. 4A). Кроме того, моноциты, подвергшиеся воздействию супернатанта CD8DC или CD8DCLPS , экспрессировали самые высокие уровни TNF-α, что в три раза больше, чем моноциты, подвергшиеся воздействию супернатанта DC или DCLPS (рис.4А). Повышенные уровни TNF-α и iNOS, экспрессируемые моноцитами, подвергнутыми воздействию супернатанта CD8DC или CD8DCLPS , по сравнению с моноцитами, подвергнутыми воздействию супернатанта DC или DCLPS , были статистически значимыми (фиг. 4B). Кроме того, уровни оксида азота (NO), продуцируемые моноцитами, подвергнутыми воздействию супернатанта CD8DC или CD8DCLPS , были значительно выше, чем уровни моноцитов, подвергнутых воздействию супернатанта DC или DCLPS (фиг. 4C). Наконец, иммуноокрашивание дополнительно подтвердило экспрессию как внутриклеточного TNF-α, так и iNOS моноцитами, подвергнутыми воздействию супернатанта CD8DC или CD8DCLPS (рис.4D и E).

Моноциты, подвергшиеся воздействию цитокиновой среды CD8-DC, экспрессируют повышенные количества TNF-α и iNOS. Моноциты культивировали с указанными супернатантами в течение 48 часов. (A) Дифференцированные моноциты, DC IL-4 / GM-CSF или макрофаги M-CSF были промыты и повторно культивированы 100 нг / мл LPS вместе с 1 мкл / мл Golgi Stop ™ в свежей среде в течение 6 часов для обнаружения внутриклеточный TNF-α и в течение 12 ч для обнаружения iNOS. Затем все клетки были проанализированы с помощью FACS.Числа представляют собой процент положительных ячеек. (B) Средняя экспрессия (среднее ± стандартное отклонение) TNF-α (белые столбцы) и iNOS (черные столбцы), продуцируемых дифференцированными моноцитами, DC и макрофагами от пяти доноров. * p <0,05; ** p <0,005 с использованием однофакторного дисперсионного анализа. (C) Продукция NO (среднее + стандартное отклонение) от трех доноров, обнаруженная с использованием диацетата DAF-FM и проанализированная с помощью FACS. * p <0,05; ** p <0,005 с использованием однофакторного дисперсионного анализа.(D) Иммуноокрашивание дифференцированных моноцитов с помощью DAPI, анти-iNOS и анти-TNF-α, наблюдаемое с помощью флуоресцентной микроскопии. (Синий, DAPI; красный, TNF-α; зеленый, iNOS). Исходное увеличение для всех панелей было × 400. (Масштаб: 20 мкм). (E) Более высокое увеличение клеток, дифференцированных супернатантом CD8DCLPS . Исходное увеличение для всех панелей составляло 630 раз. (Масштаб: 12 мкм). Результаты являются представителями трех независимых экспериментов со сравнимыми результатами.

Мы дополнительно проанализировали способность этих клеток секретировать провоспалительные цитокины.Моноциты, подвергшиеся воздействию супернатанта CD8DC или супернатанта CD8DCLPS , продуцировали значительно более высокие количества IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-12p40, GM-CSF и TNF-α по сравнению с моноцитами, подвергнутыми воздействию супернатанта DC или DCLPS. (рис. 5). Количества цитокинов, продуцируемых повторно стимулированными моноцитами, подвергнутыми воздействию супернатанта CD8DC или CD8DCLPS , также были значительно выше нестимулированных контролей (фиг. 5), что позволяет предположить, что обнаруженные цитокины не являются результатом остаточных цитокинов, перенесенных из супернатантных культур.Следовательно, эти результаты предполагают, что моноциты, подвергшиеся воздействию супернатанта CD8DC или CD8DCLPS , являются провоспалительными. Поскольку они также экспрессировали CD83 (рис. 3C), TNF-α и iNOS, они могли напоминать Tip-DC, ранее описанные у мышей 3-5 и человека 22.

Tip-DC, полученные из моноцитов, подвергшихся воздействию цитокиновой среды CD8-DC, продуцируют провоспалительные цитокины. Моноциты культивировали с супернатантами указанных культур или культуральной среды в течение 48 часов.Клетки промывали и повторно высевали в свежую среду с (черные столбцы) или без (белые столбцы) LPS. Через 18 ч супернатанты собирали и указанные цитокины измеряли с использованием множественных наборов шариков в трех повторностях. * p <0,05; ** p <0,005 с использованием однофакторного дисперсионного анализа. Результаты (среднее ± стандартное отклонение) являются представителями трех независимых экспериментов со сравнимыми результатами.

Tip-DCs направляют наивные CD4

+ Т-клетки к дифференцировке Th2

Затем мы исследовали функциональные свойства постоянного тока моноцитов, подвергнутых воздействию супернатанта CD8DC или CD8DCLPS .Подобно DC IL-4 / GM-CSF, моноциты, подвергшиеся воздействию супернатанта CD8DC или CD8DCLPS , проявляли пониженную эндоцитарную (фиг. 6A) и фагоцитарную активности (фиг. 6B). Напротив, моноциты, культивированные с супернатантом DC или DCLPS , показали устойчивый эндоцитоз (фиг. 6A) и фагоцитоз (фиг. 6B), аналогичные макрофагам M-CSF. Затем мы определили, способны ли эти клетки индуцировать пролиферацию наивных Т-клеток, которая является определяющей функцией ДК 1. Моноциты, подвергшиеся воздействию супернатанта CD8DC или CD8DCLPS и ДК IL-4 / GM-CSF, индуцировали значительное увеличение пролиферирующих Т клетки, в отличие от макрофагов и моноцитов M-CSF, культивированных с супернатантом DC или DCLPS , которые показали минимальную способность к праймингу Т-клеток (рис.6С). Эти результаты подтверждают свойства DC моноцитов, подвергшихся воздействию супернатанта CD8DC или CD8DCLPS , и их сходство с Tip-DC. Примечательно, что в то время как DC IL-4 / GM-CSF имели значительные различия в их стимулирующих способностях до и после воздействия LPS (данные не показаны), Tip-DC (моноциты, подвергшиеся воздействию супернатанта CD8DC или CD8DCLPS ) имели минимальные различия, что позволяет предположить, что последние могут быть половозрелыми, и дальнейшее созревание не увеличивает их стимулирующую способность.Примечательно, что эти Tip-DC также генерировали такой же процент Т-клеток CD4 + , продуцирующих IFN-γ, что и DC IL-4 / GM-CSF, и это было в три раза больше, чем у моноцитов, культивированных с супернатантом DC или DCLPS и Макрофаги M-CSF (рис. 6D). Т-клетки CD4 + , продуцирующие IL-10 или IL-17, обнаружены не были (данные не показаны). Примечательно, что поляризация Т-клеток CD4 + , продуцирующих IFN-γ, с помощью Tip-DC частично зависела от их экспрессии TNF-α и iNOS, как блокирующих антител против TNF-α и рецептора TNF, а также от ингибитора NOS. активность ( N G -нитро-L-аргинин метиловый эфир (L-NAME)) привела к значительному снижению процентной доли Т-лимфоцитов CD4 + , продуцирующих IFN-γ (рис.6E).

Tip-DC, полученные из моноцитов, подвергшихся воздействию цитокиновой среды CD8-DC, первично наивных CD4 + Т-клеток для Th2-ответов. Зрелые DC, зрелые макрофаги и моноциты, дифференцированные супернатантами указанных культур, анализировали на (A) эндоцитоз с использованием FITC-меченного декстрана и (B) фагоцитоз с биочастицами конъюгата Escherichia coli AF488 и анализировали с помощью проточной цитометрии. Числа представляют собой процент положительных ячеек.(C и D) Моноциты, дифференцированные указанными супернатантами или условиями, собирали и использовали в качестве APC для стимуляции аллогенных наивных CD4 + CD45RA + Т-клеток в присутствии LPS (100 нг / мл). (C) CD4 + пролиферативный ответ Т-клеток измеряли через 6 дней по включению 3 H-тимидина; результаты выражены в виде среднего числа импульсов в минуту (cpm) ± SEM для трех лунок. 1 × 10 5 Т-клеток и различное количество APC добавляли на лунку. * p <0,05, ** p <0,005 при сравнении (♦) или (□) с (▴) или (▪) с использованием одностороннего дисперсионного анализа. (D) CD4 + Т-клетки окрашивали на IL-4 и IFN-γ. Числа представляют собой процент положительных ячеек. (E) Процент IFN-γ положительных CD4 + Т-клеток (среднее ± стандартное отклонение) от трех доноров, обнаруженных с помощью FACS. Чтобы определить, влияет ли TNF-α или NO, продуцируемые моноцитами, дифференцированными супернатантом CD8DCLPS , на поляризацию Т-клеток CD4 + , дифференцированные моноциты культивировали с Т-клетками CD4 + , которые были блокированы анти-TNFR ( bTNFR) (10 мкг / мл) за 1 час до совместного культивирования, как указано.Чтобы дополнительно блокировать действие TNF-α на CD4 + Т-клетки, к указанной совместной культуре одновременно добавляли антитела против TNF-α (bTNF-α) (10 мкг / мл). Альтернативно дифференцированные моноциты обрабатывали 10 мМ L-NAME для блокирования эффектов NO в течение 1 часа при 37 ° C перед использованием в качестве APC для стимуляции наивных CD4 + Т-клеток. Дифференцированные моноциты и Т-клетки CD4 + , которые были заблокированы соответствующими блокирующими изотип антителами, служили контролем. * p <0.05 с использованием одностороннего дисперсионного анализа. Все результаты являются репрезентативными для четырех независимых экспериментов со сравнимыми результатами.

Дифференциация Tip-DC частично зависит от IFN-γ

Мы отметили, что супернатант CD8DCLPS содержал повышенное количество IFN-γ по сравнению с супернатантом DC или DCLPS (вспомогательная информационная таблица 1). Чтобы оценить, может ли IFN-γ участвовать в дифференцировке Tip-DC от моноцитов, моноциты обрабатывали антителом, блокирующим IFN-γ-рецептор, перед культивированием с супернатантом CD8DCLPS .Экспрессия CD40, CD83 (фиг. 7A) и TNF-α (фиг. 7B) с помощью Tip-DC снижалась дозозависимым образом.

Дифференциация моноцитов в Tip-DC частично зависит от IFN-γ. Моноциты культивировали с блокирующим изотип антителом (10 мкг / мл) или указанными концентрациями блокирующих рецептор IFN-γ антител (bIFN-γ R) в течение 1 ч перед добавлением супернатанта CD8DCLPS . Клетки дополнительно стимулировали LPS в течение 24 часов перед окрашиванием на (A) CD40 и CD83 или (B) внутриклеточный TNF-α с помощью проточной цитометрии.Числа представляют собой процент положительных ячеек. (C) H&E окрашивание моноцитов, активированных 500 ед / мл rh IFN-γ в течение 48 часов. Первоначальное увеличение было × 630 (шкала: 15 мкм). (D) Внутриклеточное окрашивание TNF-α и iNOS из Tip-DC по сравнению с моноцитами, которые были дифференцированы с увеличивающимися концентрациями rhIFN-γ, как указано. Числа представляют собой процент положительных ячеек. (E) Пролиферация наивных CD4 + Т-клеток (среднее ± стандартное отклонение трех измерений), количественно определенная с помощью включения 3 H-тимидина, индуцированного моноцитами, инкубированными с блокирующими изотип (биотип) или анти-IFN-γR-блокирующими антителами ( bIFN-γR) (оба 10 мкг / мл) перед дифференцировкой с супернатантом CD8DCLPS (CD8DCLPSsup) или с моноцитами, которые были дифференцированы в возрастающих концентрациях rhIFN-γ. ** p <0,005 при сравнении биотипа CD8DCLPSsup + с остальными группами. * p <0,05 при сравнении биотипа CD8DCLPSsup + с остальными группами, за исключением CD8DCLPSsup + bIFN-γ R, с использованием однофакторного дисперсионного анализа ANOVA. (F) Жизнеспособность дифференцированных моноцитов от трех доноров (среднее ± стандартное отклонение) с (черные столбцы) или без (белые столбцы) 6-часовой стимуляции LPS, оцененной клетками, отрицательными по фиксируемому фиолетовому окрашиванию мертвых клеток LIVE / DEAD ® с помощью FACS. ** p <0.005 с использованием двустороннего непарного теста Стьюдента t .

Затем мы определили, достаточно ли одного IFN-γ для дифференциации моноцитов в Tip-DC. Моноциты, подвергшиеся воздействию IFN-γ, образовывали менее обширные дендриты (фиг. 7C), чем Tip-DC (фиг. 2A), и демонстрировали вакуоли (фиг. 7C), подобные макрофагам M-CSF (фиг. 2B). Кроме того, в моноцитах, дифференцированных с увеличением доз IFN-γ, наблюдалось дозозависимое увеличение TNF-α и iNOS (рис.7D), предполагая, что IFN-γ способствует индукции TNF-α и iNOS. Однако экспрессия TNF-α и iNOS моноцитами, дифференцированными с помощью IFN-γ, была ниже, чем экспрессия Tip-DC, даже при уровнях насыщения (5000 Ед / мл) IFN-γ (фиг. 7D). Затем мы дополнительно проанализировали способность моноцитов, дифференцированных по IFN-γ, примировать наивные Т-клетки. По сравнению с необработанными моноцитами, моноциты, дифференцированные с помощью IFN-γ, индуцировали пролиферацию наивных CD4 + Т-клеток дозозависимым образом (рис.7E). Однако уровень наивной пролиферации Т-клеток CD4 + все еще был значительно ниже, чем уровень, индуцированный Tip-DC (фиг. 7E). Кроме того, блокирование рецептора IFN-γ на моноцитах перед воздействием на них супернатанта CD8DCLPS значительно снижает, но не отменяет пролиферацию наивных CD4 + Т-клеток (фиг. 7E). Интересно, что мы также заметили, что моноциты, дифференцированные с помощью IFN-γ, имели резкое снижение жизнеспособности после стимуляции LPS, чего не наблюдалось в моноцитах, культивированных с супернатантами, полученными из совместных культур (рис.7F). Взятые вместе, эти данные позволяют предположить, что IFN-γ является важным фактором, способствующим, но не единственным, в дифференцировке моноцитов в Tip-DC.

Обсуждение

Предыдущие отчеты показали, что человеческие CD8 + Т-клетки инициируют Th2-ответы путем праймирования DC для IL-12p70 14. Теперь мы показываем, что человеческие CD8 + T-клетки могут дополнительно поддерживать этот Th2-ответ во время их взаимодействия с DC, поддерживая дифференцировка моноцитов в Th2-индуцирующие Tip-DC.Это подчеркивает новую роль, которая позволяет передавать опосредованные Т-клетками CD8 + сигналы, индуцирующие Th2, без необходимости физического взаимодействия с инфильтрирующими моноцитами, подобно другим перекрестным помехам, опосредованным свидетелями, наблюдаемым в инфекционных моделях 23, 24. Это может также объясняют важность CD8 + Т-клеток в микробных инфекциях 10-12, 25, поскольку продукция TNF-α и NO с помощью Tip-DC является ключевыми эффекторами в клиренсе патогенов 3.

Мы наблюдали, что растворимых факторов из совместных культур CD8 + Т-клеток и DC человека было достаточно для дифференциации моноцитов в Th2-индуцирующие Tip-DC.Эти Tip-DC напоминают активированные DC, о чем свидетельствует их морфология, высокая экспрессия костимулирующих молекул, TLR2, 3 и 4, MHC классов I и II, DC-SIGN и классический маркер созревания DC, CD83. Функции Tip-DC были похожи на DC, а не на макрофаги, поскольку они могли индуцировать ответ MLR и проявляли пониженную фагоцитарную и эндоцитарную активность. Tip-DC также примировали наивные CD4 + Т-клетки для IFN-γ, и это частично зависело от их продукции TNF-α и NO, что может объяснить, почему остаточные ответы Th2 все еще могут возникать в отсутствие IL-12p70 26, 27.Кроме того, Tip-DCs активировали хемокиновые рецепторы CCR1, CX3CR1 и продолжали экспрессировать CCR2 и CCR5, что указывает на их роль в воспаленных тканях, где они могут играть провоспалительную роль посредством продукции TNF-α и NO. Хотя Tip-DCs не экспрессируют высокие уровни CCR7, мы не можем исключить возможность их присутствия в лимфатических узлах, где они запускают Т-клетки, поскольку моноциты могут мигрировать непосредственно в лимфатические узлы через CCR2 и дифференцироваться в DCs28.

В частности, мы показываем, что IFN-γ в нашей цитокиновой среде CD8-DC был важным фактором для дифференцировки моноцитов в клетки с характеристиками Tip-DC.Интересно, что неспособность моноцитов экспрессировать больше TNF-α и iNOS после дифференцировки с определенным уровнем IFN-γ предполагает наличие эффекта насыщения, что объясняет, почему моноциты, культивируемые с супернатантом CD8DC или супернатантом CD8DCLPS , могут дифференцироваться в Tip-DC, несмотря на то, что последние содержат большее количество IFN-γ и других цитокинов. В отличие от наших результатов, предыдущие группы продемонстрировали, что IFN-γ смещает моноциты в сторону макрофагов 29 или толерогенных DC 30 вместо этого.Однако их результаты также показали, что IFN-γ увеличивает экспрессию CD80, CD86 и CD40, а также снижает регуляцию фагоцитоза, что согласуется с характеристиками Tip-DC, наблюдаемыми в нашей модели. Эти расхождения можно объяснить различиями в экспериментальных моделях и тем фактом, что IFN-γ – не единственный фактор, участвующий в дифференцировке Tip-DC, поскольку моноцитов, дифференцированных с насыщающими уровнями IFN-γ, все еще было недостаточно для генерации жизнеспособных DC, которые могут примировать и экспрессируются как высокие уровни TNF-α и iNOS как Tip-DC.Следовательно, мы считаем, что другие факторы в супернатантах CD8-DC, такие как гомодимер IL-12p40, GM-CSF и TNF-α, могут действовать совместно с IFN-γ, вызывая дифференцировку Tip-DC.

У человека моноциты можно разделить на классические (CD14 ++ CD16 ), промежуточные (CD14 ++ CD16 + ) и неклассические (CD14 + CD16 ++ ) подгруппы и являются важными предшественниками воспалительных DCs 31. Недавнее профилирование транскрипции предоставило доказательства гомологии между подмножествами моноцитов мыши и человека и что подмножество Ly6C hi CCR2 + мыши соответствует классическому подмножеству 32 человека.Поскольку было показано, что Tip-DC у мышей возникают из моноцитов Ly6C hi CCR2 + 3, 33, вполне вероятно, что Tip-DC, наблюдаемые в нашей модели, происходят в основном из классической подгруппы, тем более что эта популяция составляет 90% общих моноцитов крови. Тем не менее, мы не можем исключить, что неклассическое подмножество может также привести к Tip-DC, поскольку было предложено, чтобы это подмножество созревало из классического подмножества и могло выражать высокие уровни TNF-α и MHC класса II 31. Следовательно, это область еще предстоит изучить.

Способность CD8 + Т-клеток влиять на дифференцировку моноцитов в Tip-DC имеет важное значение для микробного иммунитета и хронических заболеваний. В свою очередь, было показано, что Tip-DC усиливают клиренс вируса, способствуя гриппозно-специфическим CD8 + Т-клеткам в инфицированных легких 4. Поскольку наши результаты предполагают, что CD8 + Т-клетки могут вносить вклад в дифференцировку Tip-DC, оказывается, что CD8 + Т-клетки и Tip-DC могут поддерживать активность друг друга взаимным образом.Роль CD8 + Т-клеток, наблюдаемая в наших результатах, также может быть экстраполирована на исследования псориаза у людей, где снижение инфильтрации активированных Т-клеток памяти CD8 + при введении алефасепта показало снижение содержания ДК, воспаления и тканевой экспрессии IFN- γ и iNOS 19. Аналогичным образом, введение эфализумаба, антитела, которое снижает инфильтрацию Т-клеток и DC, привело к уменьшению воспаления в коже и уменьшению количества Tip-DC 22. Вероятно, что уменьшило CD8 + T- инфильтрация клеток в кожу может помочь свести к минимуму рекрутирование моноцитов и их воспалительное воздействие на дифференцировку моноцитов.В поддержку Th2-индуцирующей способности CD8 + Т-клеток также было показано, что продуцирующие iNOS DC представляют собой основной класс Th-1-регулируемой популяции эффекторных клеток во время хронической инфекции Leishmania major 34.

В совокупности наше исследование подчеркивает новую роль человеческих CD8 + Т-клеток в оркестровке Th2-ответов не только за счет быстрой инициации DC IL-12p70, но и за счет дифференцировки моноцитов в Th2-индуцирующие Tip- DC.Это дает более полное представление об их иммуномодулирующих функциях, которые могут быть применимы для разработки будущих эффективных методов лечения.

Материалы и методы

Вся кровь была собрана после получения информированного согласия в соответствии с Хельсинкской декларацией и в соответствии с протоколом, утвержденным Наблюдательным советом Национального университета Сингапура (код NUS IRB: 05-024).

Реактивы

Все клетки культивировали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM) (Gibco, Invitrogen, Singapore), и 10% инактивированной нагреванием сыворотке AB человека (Cambrex, Сингапур).Рекомбинантный человеческий (rh) IFN-γ, rhIL-2, rhIL-4, rhIL-7, rhGM-CSF и rhM-CSF были от Peprotech (Gene-Ethics, Сингапур). Человеческое антитело, блокирующее IFN-γR (GIR-208), было получено от BD Pharmingen (Biomed, Singapore). Антитела против TNF-α и TNF-рецептора были от R&D systems (Сингапур). L-NAME, форбол 12-миристат 13-ацетат (PMA), иономицин и ЛПС из Salmonella enterica серотипа Typhimurium были от Sigma Aldrich. CD3 mAb (OKT3) и CD28 mAb (CD28.2) были от BioLegend (Genomax, Сингапур).

Изоляция клеток

Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) выделяли из гепаринизированных образцов с помощью седиментации в градиенте плотности Ficoll-Paque ™ (GE Healthcare, Сингапур). CD8 + Т-клетки (97 ± 1,5% CD3 + CD8 + ) выделяли с помощью анти-CD8-конъюгированных магнитных шариков и обогащали путем истощения контаминирующих NK-клеток конъюгированными с анти-CD56 магнитными шариками. Наивные CD4 + Т-клетки (98 ± 0,7% CD4 + CD45RA + ) и моноциты (97 ± 0.5% CD14 ( + ) были выделены отрицательной селекцией с помощью набора Naive CD4 + для выделения Т-клеток и набора для выделения моноцитов II соответственно. Все магнитные шарики были приобретены у Miltenyi Biotec, и протоколы выделения выполнялись в соответствии с инструкциями производителя. Для создания классических незрелых ДК или макрофагов моноциты CD14 + периферической крови (5 × 10 5 / лунка) были дифференцированы с помощью GM-CSF и IL-4 (оба 1000 Ед / мл) или M-CSF (1000 Ед. / мл) соответственно в 24-луночных планшетах (Nunc) в течение 6 дней.ЛПС (100 нг / мл) добавляли еще на 24 ч, чтобы вызвать их созревание, где указано.

Генерация CD8, специфичных для гриппа

+ Т-клеток

CD8 крови + Т-клетки, специфичные для пептида гриппа (Flu M1; 58–66; GILGFVFTL) (Mimotopes; Мельбурн, Австралия) в контексте HLA-A2.01, окрашивали PE-меченным тетрамером и сортировали с использованием Сортировщик клеток MoFlo (Beckman Coulter, Сингапур). Выделенные клетки культивировали в течение 14 дней с ИЛ-2 (50 Ед / мл) и ИЛ-7 (5 нг / мл) и повторно стимулировали нагруженными пептидом аутологичными ДК каждую неделю.Процент связывающих тетрамер клеток составлял> 80% (рис. 1E, вставка)

Совместные культуры

Для аллогенных совместных культур были использованы CD8 + Т-клетки после выделения или активации, как указано 13. Активированные CD8 + Т-клетки были тщательно промыты и совместно культивированы с аллогенными ДК, с или без ЛПС (100 нг / мл ). Для аутологичных совместных культур незрелые рестриктированные по HLA-A2.01 DC обрабатывали 5 мкМ пептида гриппа (Flu M1; 58–66; GILGFVFTL) в течение 1 ч перед смыванием избытка пептида.Затем гриппоспецифические Т-клетки CD8 + совместно культивировали с импульсными пептидами DC с или без LPS (100 нг / мл). Все совместные культуры содержали всего 2 × 10 5 клеток при соотношении CD8 + Т-клеток к DC 2: 1 в трех лунках с использованием 96-луночных планшетов с U-образным дном (Costar), культивированных при 37 °. С / 5% СО 2 .

Исследования дифференцировки моноцитов

Для анализа влияния супернатантов совместных культур на дифференциацию моноцитов супернатанты были приготовлены из совместных культур аналогичным образом, но с небольшими модификациями.Вместо добавления ЛПС непосредственно к совместным культурам, ДК культивировали с ЛПС (100 нг / мл) в течение 3 ч перед трехкратной промывкой средой. Затем к DC добавляли CD8 + Т-клетки и собирали культуральные супернатанты через 18 часов. Затем супернатанты или культуральную среду добавляли к изолированным моноцитам (1 × 10 6 / лунку) в 24-луночных планшетах на 48 часов.

NO анализ

Для обнаружения внутриклеточного NO клетки стимулировали LPS в течение 6 часов в среде DMEM без фенолового красного (Invitrogen), содержащей 10% сыворотки AB человека, перед добавлением 5 мкМ нечувствительного к pH флуоресцентного красителя DAF-FM диацетат (Calbiochem, Merck, Сингапур) еще 30 мин при 37 ° C.Клетки промывали PBS и инкубировали еще 15 мин при 37 ° C перед анализом проточной цитометрией. Эмиссия флуоресценции DAF-FM является прямым показателем внутриклеточного содержания NO.

Анализы на фагоцитоз и эндоцитоз

Фагоцитоз определяли путем инкубации в течение 1 ч при 37 ° C с биочастицами, конъюгированными с Escherichia coli Alexa Fluor 488 (100 мкг / мл; Molecular Probes, Invitrogen). Окрашенные клетки трижды промывали холодным PBS и анализировали проточной цитометрией (Cyan-ADP, Beckman Coulter).Для измерения эндоцитоза клетки инкубировали в течение 30 минут при 37 ° C с декстраном, меченным FITC (1 мг / мл; 40000 молекулярная масса; молекулярные зонды) в культуральной среде, промывали и анализировали проточной цитометрией (Cyan-ADP). Во всех экспериментах клетки, инкубированные с зондами при 4 ° C, использовали в качестве отрицательного контроля.

Пролиферация и праймирование наивных CD4

+ Т-клеток

Наивные CD4 + Т-клетки (1 × 10 5 / лунка) культивировали совместно с увеличивающимся количеством облученных (30 Гр) дифференцированных моноцитов в 96-луночных планшетах с LPS (100 нг / мл).Пролиферативный ответ Т-клеток измеряли через 6 дней после совместного культивирования с помощью 18-часового импульса с [3 H] тимидином (1 мкКи / лунка; Amersham Pharmacia). Для окрашивания внутриклеточных цитокинов Т-клетки стимулировали PMA (10 нг / мл), иономицином (400 нг / мл) и 1 мкл / мл Golgi Stop ™ (BD Pharmingen) в течение 6 часов перед анализом содержания внутриклеточных цитокинов с помощью проточной цитометрии. .

Проточная цитометрия

Антитела, используемые для анализа: CD3-PB (клон UCHT1), CD4-FITC (клон RPA-T4), CD8-APC (клон RPA-T8), CD14-APC (клон MΦP9), CD40-FITC (клон 5C3), CD80-PE (клон L307.4), CD83-APC (клон HB15e), CD86-PE (клон 2331), DC-SIGN-PE (клон 9E9A8) и HLA-DR-FITC (клон G46-6) (все BD Pharmingen). CCR7-PE (клон 3D12), TLR2-PE (клон TLR2.1) и TLR3-PE (клон TLR3.7) были получены от eBioscience (Biomed Diagnostics). CCR1-AF647 (клон TG4 / CCR1), CCR2-AF647 (клон TG5 / CCR2), CCR5-AF647 (клон HEK / 1 / 85a), CX3CR1-AF647 (клон 2A9-1), HLA-A, B, C- PB (клон W6 / 32) и TLR4-PE (клон HTA125) были от BioLegend. TLR8-PE (клон 44C143) был от Abcam (Сингапур). Аннексин V-FITC (BD Pharmingen) и 7-аминоактиномицин-D (7-AAD) (Sigma) или набор фиксируемых фиолетовых мертвых клеток LIVE / DEAD ® для возбуждения 405 нм (Invitrogen) использовали для определения жизнеспособности клеток. .Внутриклеточные цитокины детектировали с помощью следующих антител: IFN-γ-PE (клон 25723.11) и TNF-α-PE (клон 6401.1111) были получены от BD Pharmingen. IL-4-APC (клон MP4-25D2) и перфорин-AF647 (клон dG9) были от BioLegend. Для обнаружения внутриклеточного iNOS использовали очищенные мышиные антитела против iNOS / NOS человека типа II (клон 6 / iNOS / NOS типа II) от BD Pharmingen с последующим введением вторичных антител козы против IgG PE мыши (Sigma). Сбор данных выполняли с использованием CyAn ADP и анализировали с помощью программного обеспечения Summit (Beckman Coulter).

Обнаружение цитокинов и хемокинов

IL-12p70 определяли с помощью ELISA DuoSet IL-12p70 человека (R&D Systems). IL-1α, IL-1β, IL-4, IL-6, IL-10, GM-CSF, IFN-γ, TNF-α и IP-10, RANTES, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β были определяли с использованием множественных наборов шариков (Bio-Rad, Сингапур) и анализировали с использованием планшет-ридера Luminex 100 (Qiagen, Сингапур). Все эксперименты проводились в соответствии с инструкциями производителя.

Микроскопия

Моноциты дифференцировали на покровных стеклах, засеянных в 24-луночные планшеты в 1 мл супернатантов.ЛПС (100 нг / мл) и 1 мкл / мл Golgi stop ™ (BD Pharmingen) добавляли к клеткам на 6 часов. Затем клетки фиксировали в смеси метанол / ацетон (1: 1), промывали PBS / 10 мМ глицина перед пермеабилизацией с помощью PBS, содержащего 0,5% BSA и 0,1% сапонина. Окрашивание iNOS детектировали с помощью очищенного мышиного антитела против iNOS / NOS человека типа II (клон 6 / iNOS / NOS типа II; BD Pharmingen) с последующим введением вторичного антитела козьего антимышиного IgG AF647 (Invitrogen). Окрашивание TNF-α было обнаружено с помощью PE-конъюгированного мышиного антитела против TNF-α человека (клон 6401.1111; BD Pharmingen). Все антитела использовали в конечной концентрации 5 мкг / мл. Покровные стекла просматривали под флуоресцентным микроскопом (Axio imager.Z1, камера Axiocam HRM; Carl Zeiss Micro Imaging, Сингапур) с использованием программного обеспечения AxioVision LE (версия 4.6).

Статистический анализ

Представленные результаты являются средними ± стандартное отклонение. Сравнение между двумя группами проводилось с помощью теста Стьюдента t . Сравнение между тремя или более группами было выполнено с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующим пост-тестом Тьюки.Данные анализировали с помощью Prism 5 (GraphPad). p – значения менее 0,05 считались статистически значимыми.

Благодарности

Мы благодарим Фей Чуин Лью за помощь в сортировке клеток; Chien Tei Too за синтез биотинилированного мономерного рекомбинантного HLA-A2; Кеннету Вонгу за помощь в экспериментах с тимидином; Фиону Вонг за помощь с окрашиванием H&E, всем донорам крови, которые участвовали в этом исследовании, и докторуПавлу Калинскому за полезные предложения.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *