1 школа город кашин: МБОУ средняя общеобразовательная школа №1 г. Кашина, Тверской области.

A Визуализация кластеризации по графику t-SNE для всех комбинированных образцов здорового контроля, KBD и OA, идентифицированных по типу клеток. B T-SNE графики, демонстрирующие экспрессию генов ранее описанных маркеров, используемых для идентификации клеточной идентичности каждого кластера: S110A4-прегипертрофные хондроциты; CTNNB1 – регуляторные хондроциты 1 типа; MMP13 – гипертрофические хондроциты; FRZB – эффекторные хондроциты; CHI3L1-регуляторные хондроциты 2 типа; NGF-пролиферативные хондроциты; MT1X-гомеостатические хондроциты; OLFM2-фиброхрящевые хондроциты; Клетки-предшественники STMN1-хряща.Цвет точки соответствует уровню экспрессии гена в каждой ячейке. t-SNE, t-распределенное стохастическое вложение соседей. C Тепловая карта масштабированных данных экспрессии генов для 5 лучших дифференциально экспрессируемых генов, идентифицирующих каждый кластер, со списком выбранных генов. t-SNE, t-распределенное стохастическое вложение соседей. D t-SNE график клеток в соответствии с болезненным статусом; разные кластеры содержали разное количество клеток из KBD, OA и контрольных образцов. E Средний процент от общего количества ячеек, которые содержали каждый тип ячеек, сравнивая контрольные образцы, образцы KBD и OA.Полоски показывают процент от общего числа ячеек. F Репрезентативное иммуногистохимическое окрашивание MT-ND1 и MT1X в хрящевых тканях KBD. Шкала слева, 500 мкм; справа, 50 мкм, и количественное определение положительных клеток различных областей (поверхностных, средних, глубоких) в хрящевых тканях, отображаемых прямоугольной диаграммой ( n = 5). * р <0,05.

При разделении графиков t-SNE для каждого болезненного состояния мы отметили, что кластер 8, представляющий клетки CPC, присутствовал только в нормальном хряще и в значительной степени отсутствовал как в образцах OA, так и в образцах KBD (рис.2D). Кроме того, анализ доли всех клеток, присутствующих в каждой популяции по образцам и статусу заболевания, выявил несколько значительных изменений среди нормальных хондроцитов, хондроцитов KBD и хондроцитов OA (рис. 2E). Популяции RegC и прегипертрофных хондроцитов увеличивались в хондроцитах OA по сравнению со здоровым контролем и хондроцитами KBD. Между тем, количество гипертрофических хондроцитов, FC и MTC имело тенденцию к увеличению от контроля и OA к KBD.

Расширенный кластер клеточной популяции в образцах KBD

Две отдельные популяции хондроцитов, по-видимому, увеличиваются в основном в образцах KBD по сравнению с нормальными образцами и образцами OA.К ним относятся новые MTC и HomC (рис. 2D). HomC идентифицировали по их экспрессии известных маркеров MT1X, MT2A, MT1E, ATF5 и DDIT3. Другой особой популяцией, которая заметно увеличилась в KBD, были MTC, которые представляют собой недавно определенную популяцию, которая идентифицируется по сигнатуре, которая включает гены, связанные с транспортом электронов в митохондриях и ответом на гидропероксид, включая MT-ND1, MT-ATP6, MT -ND2 и MT-ND3 гены. Экспрессию MT-ND1 и MT1X в хрящевых тканях исследовали с помощью иммуногистохимических анализов, которые подтвердили существование MTC и HomC в хряще KBD.Результаты показали, что MTCs в основном были распределены в средней и глубокой зонах, а HomCs в основном были распределены в поверхностной зоне в хряще KBD (рис. 2F). Кроме того, мы подтвердили экспрессию генов MT-ND1 и MT1X у пациентов с KBD с помощью RT-PCR и обнаружили, что результаты согласуются с анализом одноклеточной РНК-seq (дополнительный рисунок 3).

Расширенный кластер клеточной популяции при ОА и нормальных образцах

Отдельная популяция регуляторных хондроцитов, которая заметно увеличилась при ОА (рис.2D) был идентифицирован по его экспрессии известных маркеров CHI3L1, AEBP1, PLIN2 и STEAP1 (рис. 3A). Экспрессию AEBP1, CHI3L1 и STEAP1 в хрящевых тканях исследовали с помощью иммуногистохимических анализов и подтвердили наличие RegC в хряще OA. Результаты показали, что AEBP1 активируется в поверхностной и средней зонах, а CHI3L1 и STEAP1 активизируется в поверхностной, средней и глубокой зонах хрящевых тканей при ОА по сравнению с нормальными хрящевыми тканями (рис.3Б). Кроме того, мы подтвердили экспрессию генов AEBP1 и CHI3L1 у пациентов с ОА с помощью ОТ-ПЦР и обнаружили, что результаты согласуются с анализом одноклеточной РНК-seq (дополнительный рисунок 3).

A Графики экспрессии генов CHI3L1, AEBP1, STEAP1 и PLIN2. Цвет точки соответствует уровню экспрессии гена в каждой ячейке. t-SNE, t-распределенное стохастическое вложение соседей. B Репрезентативное иммуногистохимическое окрашивание AEBP1, CHI3L1 и STEAP1 при ОА и здоровых тканях хряща. Шкала слева, 500 мкм; справа, 50 мкм, и сравнительная количественная оценка положительных клеток различных областей (поверхностная, средняя, ​​глубокая) между ОА и здоровыми хрящевыми тканями, отображенная в виде прямоугольной диаграммы ( n = 5). * р <0,05.

Отчетливые CPC, которые были заметно увеличены в нормальной ткани (рис. 2D), были идентифицированы по их экспрессии известных маркеров STMN1, PTTG1, CDKN3, BIRC5, UBE2S и CENPW (рис.4А). Хотя ни один из этих маркеров не был эксклюзивным для CPC, этот кластер был единственной популяцией, экспрессирующей все эти гены. Мы исследовали экспрессию CENPW и PTTG1 в хрящевых тканях с помощью иммуногистохимических анализов и подтвердили наличие CPC в нормальном хряще (рис. 4B). Результаты показали, что CENPW активируется в средней зоне, а PTTG1 активируется в средней и глубокой зонах хрящевой ткани по сравнению с нормальным контролем. Кроме того, экспрессия PTTG1 и BIRC5 была исследована в хрящевых тканях пациентов с ОА и KBD, и результаты показали, что PPTG1 и BIRC5 были активированы в поверхностной зоне хряща OA, в то время как они были активированы в глубокой зоне хряща KBD ( Дополнительный рис.4).

A Графики экспрессии генов CENPW, PTTG1 и BIRC5. Цвет точки соответствует уровню экспрессии гена в каждой ячейке. t-SNE, t-распределенное стохастическое вложение соседей. B Репрезентативное иммуногистохимическое окрашивание CENPW и PTTG1 в здоровых хрящевых тканях. Шкала слева, 500 мкм; справа, 50 мкм, и количественное определение положительных клеток различных областей (вверх, в середине, глубоко) в здоровых хрящевых тканях, отображаемых прямоугольной диаграммой ( n = 5).* р <0,05. C , D Псевдовременная траектория монокля, показывающая прогрессирование KBD, OA и контроля. E Экспрессия генов зависимым образом. В каждой строке указаны стандартизованные кинетические кривые гена. В центре тепловой карты показано значение кинетической кривой в корне траектории. От центра к левому краю тепловой карты кинетическая кривая продвигается от корня по траектории к судьбе 1. Начиная с правого края, кривая от корня к судьбе 2.

Выравнивание траектории отдельных клеток в нормальных хондроцитах, хондроцитах KBD и OA

Для дальнейшего изучения взаимосвязи между различными состояниями болезни мы использовали монокль для изучения переходов между конкретными типами клеток и состояниями образцов. Мы обнаружили, что псевдокосмическая ось траектории, полученная из монокля, дала три различных состояния траектории (рис. 4C). Хондроциты из нормального хряща присутствовали в начале псевдокосмической траектории, которая затем разветвлялась на 2 разных судьбы, населенных в основном либо KBD (судьба 1), либо OA (в основном судьба 2) (рис.4D).

Затем мы оценили экспрессию генов, регулируемых во время дифференцировки хондроцитов в клетках на участках 1 и 2 траектории. Уровни экспрессии FN1, CHI3L2, RGCC, COL9A3 и MDFI были заметно повышены в клетках в судьбе 1, тогда как уровни экспрессии COL11A1, SMOC2 и FBXO2 были немного подавлены на ранней стадии дифференцировки и заметно повышены в клетках судьбы 1. HMOX1, COL1A1, WISP2, CD9 и PCOLCE заметно активировались в клетках в судьбе 2 и подавлялись в клетках в судьбе 1.IGF1, VCAN, PCSK5 и SPP1 активируются только в клетках судьбы 2 (фиг. 4E). Эти гены дифференциально экспрессировались в точке перед ветвлением, что позволяет предположить, что эти гены могут играть критическую роль в регуляции фенотипа хондроцитов в начале процесса дифференцировки или развития хондроцитов от здорового контроля до KBD или OA.

Прекипертрофные хондроциты, гипертрофические хондроциты, регуляторные хондроциты и эффекторные хондроциты

Прегипертрофные хондроциты, гипертрофические хондроциты, RegC и эффекторные хондроциты из кластеров 3 и 4 (рис.5A, B) были объединены и повторно кластеризованы для более четкой идентификации этих субпопуляций. Гипертрофические хондроциты-A (HTC-A) и гипертрофические хондроциты-B (HTC-B) были отмечены устойчивой экспрессией IGF2 и SLC5A3, MMP3 и GDF5. PreHTC и ECs высоко экспрессировали S100A4 и HLA-B, MIA и PLA2G2A, соответственно. CHI3L1 и AEBP1 были высоко экспрессированы в RegC (фиг. 5C).

A Визуализация повторной кластеризации по графику t-SNE исходного кластера 3 и 4, идентифицированного по типу ячейки. B T-SNE графики, демонстрирующие экспрессию генов маркеров, используемых для идентификации клеточной идентичности каждого кластера. Цвет точки соответствует уровню экспрессии гена в каждой ячейке. C Скрипочные графики экспрессии генов маркеров хондроцитов путем перекластеризации исходных кластеров 3 и 4.

Субпопуляция фиброхрящевых хондроцитов

При изучении популяций FC в комбинированном анализе KBD, OA и хондроцитов здорового человека мы снова идентифицировали отдельные популяции IGFBP5. ^hi и COL14A1 ^hi FC, каждая из которых содержит KBD, OA и хондроциты здорового человека.Возникли две основные и три второстепенные субпопуляции ФК (рис. 6А, Б). Первую крупную популяцию определяли по экспрессии RPS4Y1 и PENK (RPS4Y1 ^hi FC). Вторую крупную популяцию определяли по экспрессии COL3A1 (COL3A1 ^hi FC). Три минорные популяции различались по экспрессии FGF1, IGFBP6 и COL14A1 (фиг. 6C).

A Визуализация повторной кластеризации по графику t-SNE исходных кластеров 3 и 4, идентифицированных по типу ячейки. B T-SNE графики, демонстрирующие экспрессию генов маркеров, используемых для идентификации клеточной идентичности каждого кластера. Цвет точки соответствует уровню экспрессии гена в каждой ячейке. C Скрипичные графики экспрессии генов маркеров хондроцитов путем перекластеризации исходных хондроцитов фиброзного хряща.

Идентификация популяций эффекторных и гипертрофических хондроцитов в хондроцитах KBD и OA

Мы отдельно проанализировали хондроциты пациентов с KBD и OA.Было идентифицировано семь популяций хондроцитов как при KBD, так и при OA. Популяция EC была определена по экспрессии MIA, S100B, FRZB, C2orf82 и S100A1 как в KBD, так и в OA (дополнительный рис. 5), предполагая, что эти маркеры из EC были охарактеризованы как имеющие одинаковый паттерн экспрессии в KBD и OA. Кроме того, HTC определяли по экспрессии IBSP, MMP13, RUNX2 и TMEM119 в хондроцитах KBD (дополнительный рисунок 6).

Интеграция профилей метилирования ДНК по всему геному и экспрессии мРНК позволила выявить различные молекулярные особенности между болезнью Кашина-Бека и первичным остеоартритом | Исследования и терапия артрита

Генетические варианты в гене ITPR2 связаны с болезнью Кашина-Бека в Тибете

Mol Genet Genomic Med. 2019 июл; 7 (7): e00715.

Сюэ Хэ

^{1 ​​} Ключевая лаборатория молекулярных механизмов и интервенционных исследований заболеваний плато в Тибетском автономном районе, Медицинская школа, Университет Сизан Миньцзу, Сяньян, Китай,

² Ключевая лаборатория высокогорной среды и генов, связанных с болезнями Тибетского автономного района, Медицинский факультет, Университет Сизан Миньцзу, Сяньян, Китай,

³ Ключевая лаборатория фундаментальных исследований в области наук о жизни Тибетского автономного района, Медицинский факультет, Университет Сизан Миньцзу, Сяньян, Китай,

Мэй Бай

^{1 ​​} Ключевая лаборатория молекулярных механизмов и интервенционных исследований заболеваний плато в Тибетском автономном районе, Медицинская школа, Университет Сизан Миньцзу, Сяньян, Китай,

² Ключевая лаборатория высокогорной среды и генов, связанных с болезнями Тибетского автономного района, Медицинский факультет, Университет Сизан Миньцзу, Сяньян, Китай,

³ Ключевая лаборатория фундаментальных исследований в области наук о жизни Тибетского автономного района, Медицинский факультет, Университет Сизан Миньцзу, Сяньян, Китай,

Мин Лю

⁴ Отделение гинекологии и акушерства, Вторая дочерняя больница Сианьского университета Цзяотун, Сиань, Китай,

⁵ Отделение гинекологии и акушерства, Народная больница префектуры Нгари, Префектура Нгари, Китай,

Ли Ван

^{1 ​​} Ключевая лаборатория молекулярных механизмов и интервенционных исследований болезней плато в Тибетском автономном районе, Школа медицины, Университет Сизан Миньцзу, Сяньян, Китай,

² Ключевая лаборатория высокогорной среды и генов, связанных с болезнями Тибетского автономного района, Медицинский факультет, Университет Сизан Миньцзу, Сяньян, Китай,

³ Ключевая лаборатория фундаментальных исследований в области наук о жизни Тибетского автономного района, Медицинский факультет, Университет Сизан Миньцзу, Сяньян, Китай,

Юнцзюнь Хэ

^{1 ​​} Ключевая лаборатория молекулярных механизмов и интервенционных исследований заболеваний плато в Тибетском автономном районе, Медицинская школа, Университет Сизан Миньцзу, Сяньян, Китай,

² Ключевая лаборатория высокогорной среды и генов, связанных с болезнями Тибетского автономного района, Медицинский факультет, Университет Сизан Миньцзу, Сяньян, Китай,

³ Ключевая лаборатория фундаментальных исследований в области наук о жизни Тибетского автономного района, Медицинский факультет, Университет Сизан Миньцзу, Сяньян, Китай,

Хао Жун

^{1 ​​} Ключевая лаборатория молекулярных механизмов и интервенционных исследований заболеваний плато в Тибетском автономном районе, Медицинская школа, Университет Сизан Миньцзу, Сяньян, Китай,

² Ключевая лаборатория высокогорной среды и генов, связанных с болезнями Тибетского автономного района, Медицинский факультет, Университет Сизан Миньцзу, Сяньян, Китай,

³ Ключевая лаборатория фундаментальных исследований в области наук о жизни Тибетского автономного района, Медицинский факультет, Университет Сизан Миньцзу, Сяньян, Китай,

Донъя Юань

^{1 ​​} Ключевая лаборатория молекулярных механизмов и интервенционных исследований заболеваний плато в Тибетском автономном районе, Медицинская школа, Университет Сизан Миньцзу, Сяньян, Китай,

² Ключевая лаборатория высокогорной среды и генов, связанных с болезнями Тибетского автономного района, Медицинский факультет, Университет Сизан Миньцзу, Сяньян, Китай,

³ Ключевая лаборатория фундаментальных исследований в области наук о жизни Тибетского автономного района, Медицинский факультет, Университет Сизан Миньцзу, Сяньян, Китай,

Тианбо Цзинь

^{1 ​​} Ключевая лаборатория молекулярных механизмов и интервенционных исследований заболеваний плато в Тибетском автономном районе, Медицинская школа, Университет Сизан Миньцзу, Сяньян, Китай,

² Ключевая лаборатория высокогорной среды и генов, связанных с болезнями Тибетского автономного района, Медицинский факультет, Университет Сизан Миньцзу, Сяньян, Китай,

³ Ключевая лаборатория фундаментальных исследований в области наук о жизни Тибетского автономного района, Медицинский факультет, Университет Сизан Миньцзу, Сяньян, Китай,

^{1 ​​} Ключевая лаборатория молекулярных механизмов и интервенционных исследований болезней плато в Тибетском автономном районе, Школа медицины, Университет Сизан Миньцзу, Сяньян, Китай,

² Ключевая лаборатория высокогорной среды и генов, связанных с болезнями Тибетского автономного района, Медицинский факультет, Университет Сизан Миньцзу, Сяньян, Китай,

³ Ключевая лаборатория фундаментальных исследований в области наук о жизни Тибетского автономного района, Медицинский факультет, Университет Сизан Миньцзу, Сяньян, Китай,

⁴ Отделение гинекологии и акушерства, Вторая дочерняя больница Сианьского университета Цзяотун, Сиань, Китай,

⁵ Отделение гинекологии и акушерства, Народная больница префектуры Нгари, Префектура Нгари, Китай,

Поступило 19.11.2018 г .; Пересмотрено 22 марта 2019 г .; Принято 15 апреля 2019 г.

Реферат

Предпосылки

Болезнь Кашина-Бека (БКБ) – хроническая эндемическая остеоартропатия.Инозитол-1,4,5-трифосфатный рецептор 2 типа ( ITPR2 ) Ген участвует в хондроцитах. Мы предположили, что однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) в гене ITPR2 могут иметь ассоциацию с KBD в тибетском языке.

Методы

Для доказательства этой гипотезы были отобраны восемь SNP (rs1049376, rs11048526, rs11048556, rs11048585, rs16931011, rs10842759, rs2230372 и rs7134213), которые были генотипированы в группе 316 пациентов из группы контроля.Связь между вариантами ITPR2 и риском KBD оценивалась с помощью анализа логистической регрессии.

Результаты

Исследование выявило значимую ассоциацию ( p = 0,019) между KBD и новым локусом, ITPR2, SNP rs11048526 (OR = 1,49, 95% CI = 1,07–2,08). Частота варианта генотипа A / G в rs11048526 имела значительно повышенный риск KBD в кодоминантной модели (OR = 3,70, 95% CI = 1,26–10,89, p = 0,018), в доминантной модели (OR = 3.56, 95% ДИ = 1,22–10,40, p = 0,020), логарифмическая аддитивная модель (OR = 3,00, 95% ДИ = 1,12–8,00, p = 0,029) с поправкой на возраст и пол.

Заключение

Результаты указывают на потенциальную связь между ITPR2 и риском KBD на тибетском языке. Необходима дальнейшая работа, чтобы подтвердить эти результаты и изучить механизмы этих эффектов.

Ключевые слова: исследование случай-контроль, ITPR2 , болезнь Кашина-Бека, однонуклеотидные полиморфизмы, тибетский

Аббревиатуры

CI

доверительный интервал

ERP

ERR

Глобальное исследование ассоциации

HWE

Равновесие Харди – Вайнберга

ITPR2

Инозитол 1,4,5-трифосфатный рецептор типа 2

KBD

Болезнь Кашина-Бека

OA

OA

отношения шансов

ПКР

почечно-клеточная карцинома

SNP

однонуклеотидный полиморфизм

WHR

Отношение талии к бедрам

1.ИСТОРИЯ ВОПРОСА

Болезнь Кашина-Бека (KBD) – это хроническая эндемическая остеоартропатия, которая проявляется в деформации суставов и задержке роста (Hao et al., 2016, 2017). Китай является страной с наибольшей заболеваемостью КБД в мире, а тибетцы – это люди, наиболее пострадавшие от КЗБ в Китае (Tai et al., 2017) . Согласно неполным статистическим данным, в 2013 г. в 377 округах 13 провинций или автономных регионов Китая насчитывалось 0,64 миллиона пациентов с КБД и 1,16 миллиона пациентов из группы риска (Guo et al., 2014). Эндемический дефицит селена, серьезное заражение злаков грибами, продуцирующими микотоксины, и высокий уровень гуминовой кислоты в питьевой воде могут быть основными экологическими причинами КБД (Duan et al., 2010). В зависимости от тяжести поражения суставов KBD клинически классифицируется на три степени. По сравнению с I, II и III степенями, пациенты с KBD имеют значительную недостаточность роста и развития скелета, такую ​​как укороченные пальцы, укороченные плечевые кости и низкий рост (Hao et al., 2017).

Результаты недавних эпидемиологических и генетических исследований показывают, что взаимодействие между факторами окружающей среды и генами восприимчивости может играть роль в KBD (Shi, Zhang, Lv, Wen, & Guo, 2015).Патогенез KBD остается неясным (Zhang et al., 2015). Zhang et al. отобрали 559 пациентов с KBD и 467 здоровых контрольных субъектов для выявления генов восприимчивости к KBD путем проведения двухэтапного общегеномного исследования ассоциации (GWAS) и определили, что ITPR2 (инозитол-1,4,5-трифосфатный рецептор типа 2; OMIM: 600144) влияет на восприимчивость к KBD у ханьских китайцев. (Zhang et al., 2015). Tai et al. отобрав однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) 14 генов, которые состоят из 849 пациентов с KBD и 565 нормальных контролей для исследования ассоциации в тибетской популяции, они обнаружили, что rs7775 в гене FRZB может повышать восприимчивость к KBD, тогда как rs7033979 в Ген ASPN может играть защитную роль в предрасположенности к KBD у тибетцев.Более того, генетические варианты в генах COL10A1 и HABP2 могут играть роль в риске развития KBD в тибетской популяции (Tai et al., 2017). Хуанг и др. исследовать ассоциацию генов селенопротеинов GPX1 , TrxR2 и DIO2 с KBD в тибетской популяции. Они обнаружили, что отдельные SNP в генах GPX1 , TrxR2 и DIO2 не могут быть значительно связаны с KBD в тибетской популяции (Huang et al., 2013). Было идентифицировано несколько других генов восприимчивости к KBD, включая HLA-DRB1 (Shi et al., 2011), GPX4 (Du et al., 2012), GPX1 (Huang et al., 2013; Xiong et al., al., 2010), ABI3BP (Zhang et al., 2014), SEPS1 (Du et al., 2015), ITPR2 (Zhang et al., 2015), ADAM12 (Hao et al. , 2016), COL2A1 (Hao et al., 2017) и т. Д. Генетический риск KBD, объясняемый сообщенными генами восприимчивости, ограничен, что предполагает наличие некоторых новых SNP в генах восприимчивости ITPR2 в тибетском языке.

Мы отобрали восемь SNP (rs1049376, rs11048526, rs11048556, rs11048585, rs16931011, rs10842759, rs2230372 и rs7134213) ITPR2 для дальнейшего генотипирования вариантов ITPR2 , чтобы понять генетические ассоциации между ITPR и KBD по-тибетски лучше. Наше исследование может предоставить более важные доказательства для дальнейшего понимания патогенеза KBD.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

2.1. Редакционная политика и этические соображения

Протоколы этого исследования были одобрены Этическим комитетом Университета Сизан Миньцзу и соответствуют Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации.Все участники были проинформированы в письменной и устной форме о процедурах и целях исследования и подписали документы об информированном согласии. Все последующие анализы исследований проводились в соответствии с утвержденными инструкциями и правилами.

2.2. Участники исследования

В период с июня 2017 года по июль 2018 года в Народной больнице префектуры Нгари, Китай, последовательно набрали в общей сложности 316 пациентов с KBD и 320 здоровых людей из контрольной группы. Всем участникам недавно был поставлен диагноз KBD после тщательного клинического обследования и рентгенографии скелетной системы.Пациенты с генетическими заболеваниями костей и хрящей, первичным остеоартритом (ОА), ревматоидным артритом или семейным анамнезом суставных заболеваний были исключены из исследования. Контрольные группы были случайным образом отобраны из центра физического осмотра Народной больницы префектуры Нгари: без КБД и без первичного или вторичного ОА. У всех контрольных пациентов в анамнезе не было рака.

2.3. Выбор SNP и генотипирование

Используя базу данных 1,000 Genomes Project (http: //www.1000genomes.org /) и dbSNP (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/), кандидаты SNP в гене ITPR2 с частотами минорных аллелей (MAF)> 5% в глобальной популяции. Всего для дальнейшего генотипирования было отобрано восемь SNP (rs1049376, rs11048526, rs11048556, rs11048585, rs16931011, rs10842759, rs2230372 и rs7134213).

Образцы периферической крови (5 мл) были взяты от каждого участника. Геномную ДНК выделяли из периферической крови больных и контрольных пациентов с помощью набора для очистки геномной ДНК цельной крови GoldMag ‐ Mini (GoldMag Co.Ltd., г. Сиань, Китай) в соответствии с рекомендациями производителя (Geng et al., 2015). Концентрацию ДНК определяли на спектрофотометре NanoDrop Lite (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) (Wang et al., 2015). Нанодиспенсер MassARRAY (Agena Bioscience, Сан-Диего, Калифорния) был использован для создания праймеров для процесса амплификации и реакций удлинения одного основания (Jin et al., 2015). Генотипирование SNP проводили на платформе MassARRAY iPLEX (Agena Bioscience, SanDiego, CA). Agena Bioscience Typer 4.0 использовалось для управления и анализа генотипических данных SNP.

2.4. Статистический анализ

Статистический анализ выполняли с использованием программного обеспечения Microsoft Excel, SPSS 16.0 (SPSS, Чикаго, Иллинойс) и PLINK 1.07. Отклонение от равновесия Харди – Вайнберга (HWE) было проверено на контрольных субъектах для измерения распределения полиморфизма с использованием критерия хи-квадрат (Ren et al., 2016). Двусторонний p -значение менее 0,05 считалось статистически значимым. Риск, связанный с отдельными генотипами и аллелями, рассчитывался как отношение шансов (OR) с их 95% доверительным интервалом (95% ДИ) на основе анализа моделей логистической регрессии (Bland & Altman, 2000).Программный пакет Haploview (версия 4.2) использовался для анализа неравновесия по сцеплению, построения гаплотипов (Barrett, Fry, Maller, & Daly, 2005; Shi & He, 2005). Связи между гаплотипами и риском КБД были проанализированы с помощью PLINK. Мы использовали безусловный логистический регрессионный анализ с поправкой на возраст и пол, чтобы определить связь между гаплотипами и KBD.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ

Когорта из 316 неродственных пациентов с КБД со средним возрастом 54,70 ± 17 лет.14 лет и 320 неродственных контролей со средним возрастом 19,05 ± 1,60 года, участвовавших в этом исследовании случай-контроль, были представлены в таблице. Наблюдалась значительная разница в возрасте между группами пациентов и контрольной группой ( p <0,0001).

Таблица 1

Характеристики случаев и контроля в этом исследовании

Таблица показывает основную информацию и частоты аллелей для каждого SNP у пациентов с KBD и здоровых людей в контрольной группе.Ясно, что информация, полученная из таблицы, в отношении SNP и их хромосомного положения, аллеля, частоты минорных аллелей для случаев и контролей, а также результатов теста HWE. Ни один из них не отличался от ожидаемых HWE ( p > 0,05), что указывает на хорошее качество генотипирования SNP. Частота минорного аллеля в rs11048526 составляла 0,150 для случаев по сравнению с 0,106 для контроля, которые имели значительную разницу в частоте аллелей между случаями и контрольными группами; и люди, носители аллеля «A», увеличивали риск KBD по сравнению с людьми с аллелем «G» в модели аллеля (OR = 1.49, 95% ДИ = 1,07–2,08, p = 0,019).

Таблица 2

Сравнение частот аллелей между случаями и контролем

Сравнение генотипов SNP и генетических моделей риска KBD были представлены в табл. Мы наблюдали, что частота гетерозиготного варианта A / G генотипа у ITPR2 rs11048526 была значительно больше у пациентов с KBD, чем у здоровых людей из контрольной группы, и имела повышенный риск KBD в соответствии с ко-доминантной моделью (OR = 3.70, 95% ДИ = 1,26–10,89, p = 0,018), доминирующая модель (OR = 3,56, 95% CI = 1,22–10,40, p = 0,020) и логарифмическая аддитивная модель (OR = 3,00, 95 % CI = 1,12–8,00, p = 0,029) с поправкой на возраст. Мы также наблюдали, что частота гетерозиготного варианта A / G генотипа у ITPR2 rs11048556 была значительно меньше у пациентов с KBD, чем у здоровых контролей, и имела повышенный риск KBD в соответствии с ко-доминантной моделью (OR = 1,86, 95% CI = 1.10–3.13, p = 0.020), рецессивная модель (OR = 1,84, 95% CI = 1,12–3,03, p = 0,016) до поправки на возраст, но не было никакой связи после анализа поправок.

Таблица 3

Анализ генотипической модели взаимосвязи между SNP и риском KBD

4. ОБСУЖДЕНИЕ

В этом исследовании мы выполнили восемь новых SNP (rs1049376, rs11048526, rs11048556, rs11048585, rs13421142, rs13421142, rs13421142) ITPR2 ген, связанный с KBD у тибетцев.SNP rs11048526 в значительной степени ассоциировался с KBD, что увеличивало риск KBD, результаты нашего исследования также подтверждают, что ITPR2 , вероятно, является геном восприимчивости KBD.

Инозитол-1,4,5-трифосфатный рецептор ( IP ₃ R ) типа 2 – это белок, который у человека кодируется геном ITPR2 , принадлежащим к семейству IP ₃ R, который содержит три изоформы. Белок, кодируемый этим геном, является одновременно рецептором инозитолтрифосфата и кальциевым каналом.IP ₃ Rs функционируют как внутриклеточные каналы Ca ²⁺ , расположенные в мембране эндоплазматического ретикулума (ER). Посредством связывания IP ₃ , IP ₃ Rs опосредуют мобилизацию Ca ²⁺ из ER в цитоплазму и играют ключевую роль в регуляции физиологических процессов. In vivo IP ₃ R имеют широкое распространение в тканях и клетках, включая хондроциты (Evans, Shen, Pollack, Aloia, & Yeh, 2005). В качестве проапоптотических регуляторов, IP ₃ R опосредованные кальциевые каналы играют важную роль в поддержании внутриклеточного гомеостаза Ca ²⁺ , что важно для контроля прогрессирования апоптоза (Boehning, Patterson, & Snyder, 2004).Хотя потенциальный молекулярный механизм ITPR2 , участвующий в развитии KBD, остается неясным, разумно предположить, что ITPR2 вносит вклад в аномальный апоптоз хондроцитов в суставном хряще пациентов с KBD.

Это было причастность ITPR2 в KBD у ханьского Китая Сообщалось, что во всем геноме один SNP ITPR2 (rs10842750) был в значительной степени связан с KBD, наводящие на размышления доказательства ассоциации на ITPR2 SNP были наблюдались значимые ассоциации между KBD и семью SNP, выбранными из анализа вменения, включая rs1531928, rs4414322, rs11048570, rs11048572, rs2017510, rs9669395 и rs1002835 (Zhang et al., 2015). В нашем исследовании ITPR2 также влияет на возникновение KBD у тибетцев. Аллель «A» rs11048526 в ITPR2 оказывал значительное разрушительное действие на KBD. Следовательно, разумно сделать вывод, что ген ITPR2 играл важную роль в восприимчивости к KBD, подвергавшихся воздействию той же окружающей среды. Больше не было опубликовано статей о rs11048526 в гене ITPR2 с риском заболевания. В некоторых исследованиях сообщалось о связи гена ITPR2 с другими заболеваниями.Cecile et al. исследования показали, что локусы rs718314 около ITPR2-SSPN обнаруживают выраженный половой диморфизм, который сильнее влияет на соотношение талии и бедер (WHR) у женщин, чем у мужчин (Heid et al., 2010). В другом исследовании локус около ITPR2-SSPN (rs12814794) показал номинальную связь с WHR у латиноамериканских женщин в США (Graff et al., 2013). В независимом GWAS Wu et al. идентифицировали два распространенных варианта rs718314 и rs1049380 в гене ITPR2 как новые локусы восприимчивости к почечно-клеточной карциноме (ПКР; Wu et al., 2012).

В этом исследовании были некоторые ограничения. Следует отметить, что в исследовании случай-контроль наблюдалась значительная разница в возрасте между группой KBD и контрольной выборкой. Чтобы исключить возможное влияние возраста на результаты, необработанные фенотипы были скорректированы с учетом возраста в качестве ковариаты перед анализом ассоциации. Количество выбранных SNP было ограничено в генах ITPR2 , а размер выборки был небольшим. Следовательно, результаты необходимо проверять с помощью хорошо спланированных высококачественных исследований четко определенных популяций.Необходимы дальнейшие исследования, чтобы подтвердить наши открытия и раскрыть потенциальный молекулярный механизм ITPR2, участвует в развитии KBD.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, наше исследование предоставило потенциальные доказательства того, что генетические полиморфизмы ITPR2 могут способствовать риску KBD у тибетцев. Далее мы продолжим изучение молекулярного механизма гена ITPR2 , влияющего на возникновение KBD.

6. КОНКУРЕНЦИЯ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

БЛАГОДАРНОСТИ

Мы хотели бы поблагодарить всех пациентов и отдельных лиц, участвовавших в этом исследовании, за их участие. Мы также очень благодарны за помощь клиницистам и всему персоналу Народной больницы префектуры Нгари, предоставившим образцы крови и данные для этого исследования.

Банкноты

Хэ Х, Бай М., Лю М. и др. Генетические варианты в гене ITPR2 связаны с болезнью Кашин-Бека у тибетцев. Mol Genet Genomic Med.2019; 7: e715 10,1002 / мг3,715 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Информация о финансировании

Работа поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (№ 81560516).

ССЫЛКИ

• Барретт, Дж. К. , Фрай, Б. , Маллер, Дж. , & Дейли, М. Дж. (2005). Haploview: Анализ и визуализация карт LD и гаплотипов. Биоинформатика, 21 (2), 263–265. 10.1093 / биоинформатика / bth557 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Блэнд, Дж.М. , & Альтман, Д. Г. (2000). Примечания к статистике. Отношение шансов. BMJ, 320 (7247), 1468. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Бенинг, Д. , Паттерсон, Р.Л. , & Снайдер, С.Х. (2004). Апоптоз и кальций: новые роли цитохрома с и инозитол-1,4,5-трифосфата. Cell Cycle, 3 (3), 252–254. [PubMed] [Google Scholar]
• Ду, X. , Дай, X. X. , Ся Сун, Р. , Zou, X. Z. , Ян Сунь, В. , Мо, X. Y. ,… Сюн, Ю.М. (2012). Экспрессия SNP и мРНК глутатионпероксидазы 4 при болезни Кашина-Бека.Британский журнал питания, 107 (2), 164–169. 10.1017 / S0007114511002704 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Ду, Х.А. , Ван, Х. М. , Дай, X. X. , Коу, Ю. , Ву, Р. П. , Чен, К. ,… Сюн, Ю.М. (2015). Роль селенопротеина S (SEPS1) -105G> A и сигнальный путь PI3K / Akt в болезни Кашина-Бека. Хрящевой остеоартрит, 23 (2), 210–216. 10.1016 / j.joca.2014.11.017 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Дуань, К. , Го, X. , Чжан, X. , Ю, Х.Дж. , Ян, Х. , Гао, Ю. ,… Ламми, М. (2010). Сравнительный анализ профилей экспрессии генов между первичным остеоартритом коленного сустава и остеоартритом, эндемичным для Северо-Западного Китая, болезнью Кашина-Бека. Артрит и ревматизм, 62 (3), 771–780. 10.1002 / арт.27282 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Эванс, Дж. Ф. , Шен, К. Л. , Поллак, С. , Алоя, Дж. Ф. , & Да, Дж. К. (2005). Адренокортикотропин вызывает временное повышение уровня свободного внутриклеточного кальция ([Ca2 +] i) и увеличивает базальный [Ca2 +] i в покоящихся хондроцитах через фосфолипазу C-зависимый механизм.Эндокринология, 146 (7), 3123–3132. 10.1210 / en.2004-1612 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Гэн, Т. Т. , Сюнь, X. , Ли, С. , Фэн, Т. , Ван, Л. П. , Джин, Т. , & Хоу, П. (2015). Связь вариантов восприимчивости к колоректальному раку с раком пищевода у населения Китая. Всемирный журнал гастроэнтерологии, 21 (22), 6898–6904. 10.3748 / wjg.v21.i22.6898 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Графф, М. , Фернандес-Родос, Л., Лю, С. , Карлсон, К. , Вассертхайль-Смоллер, С. , Нойхаузер, М. ,… Норт, К.Э. (2013). Обобщение генетических локусов ожирения среди испаноязычных женщин в США. Питание Диабет, 3, e85 10.1038 / nutd.2013.26 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Го, X. , Ма, В. Дж. , Чжан, Ф. , Рен, Ф. Л. , Цюй, К. Дж. , & Ламми, М. Дж. (2014). Последние достижения в исследовании эндемической остеохондропатии в Китае: болезнь Кашина-Бека. Остеоартрозный хрящ, 22 (11), 1774–1783.10.1016 / j.joca.2014.07.023 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Хао, Дж. , Ван, В. , Вэнь, Ю. , Сяо, X. , Он, А. , Го, X. ,… Чжан, Ф. (2016). Двумерное исследование ассоциации всего генома идентифицирует ADAM12 как новый ген восприимчивости к болезни Кашина-Бека. Научные отчеты, 6, 31792 10.1038 / srep31792 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Хао, Дж. , Ван, В. , Вэнь, Ю. , Сяо, X. , Он, А. , Ву, С. ,… Чжан, Ф. (2017). Полногеномное ассоциативное исследование идентифицирует локус COL2A1, участвующий в нарушении развития кисти при болезни Кашина-Бека.Научные отчеты, 7, 40020 10.1038 / srep40020 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Хейд, И.М. , Джексон, А.У. , Рэндалл, Дж. , Винклер, Т. , Ци, Л. , Штайнторсдоттир, В. ,… Линдгрен, К.М. (2010). Метаанализ выявил 13 новых локусов, связанных с соотношением талии и бедер, и выявил половой диморфизм в генетической основе распределения жира. Nature Genetics, 42 (11), 949–960. 10,1038 / нг.685 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Хуанг, Л., Ши, Ю. , Лу, Ф. , Чжэн, Х. , Лю, X. , Гонг, Б. ,… Ян, З. (2013). Изучение ассоциации полиморфизмов генов селенопротеинов и болезни Кашина-Бека и концентрации селена / йода в сыворотке крови в тибетской популяции. PLoS ONE, 8 (8), e71411 10.1371 / journal.pone.0071411 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Джин, Т. , Рен, Ю. , Ши, X. , Иржи, М. , Курицы. , Фэн, Т. ,… Канг, Л. (2015). Генетические вариации гена CLNK и гена ZNF518B связаны с подагрой в наборах образцов случай-контроль.Rheumatology International, 35 (7), 1141–1147. 10.1007 / s00296-015-3215-3 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Рен, Ю.С. , Джин, Т. , Солнце, X. , Гэн, Т. Т. , Чжан, М. X. , Ванга, Л. ,… Чен, К. (2016). Полиморфизм генов PDK2 и ABCG2 коррелирует с уровнями глюкозы в крови и мочевой кислоты у пациентов с тибетской подагрой. Генетика и молекулярные исследования, 15 (1) .10.4238 / gmr.15017447 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Ши, X. , Чжан, Ф. , Lv, A. , Вэнь, Ю., & Го, X. (2015). Полиморфизм гена COL9A1 связан с болезнью Кашина-Бека в популяции хань северо-запада Китая. PLoS ONE, 10 (3), e0120365 10.1371 / journal.pone.0120365 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Ши, Ю.Ю. , & Он, Л. (2005). SHEsis, мощная программная платформа для анализа неравновесия по сцеплению, конструирования гаплотипов и генетической ассоциации в локусах полиморфизма. Cell Research, 15 (3), 97–98. [PubMed] [Google Scholar]
• Ши, Ю., Лу, Ф. , Лю, X. , Ван, Ю. , Хуанг, Л. , Лю, X. ,… Ян, З. (2011). Генетические варианты в гене HLA-DRB1 связаны с болезнью Кашина-Бека в тибетской популяции. Артрит и ревматизм, 63 (11), 3408–3416. 10.1002 / арт.30526 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Тай, З. , Хуанг, Л. , Лу, Ф. , Ши, Ю. , Ма, С. , Ченг, Дж. ,… Ян, З. (2017). Ассоциативное исследование генов-кандидатов на предрасположенность к болезни Кашина-Бека в тибетской популяции. BMC Medical Genetics, 18 (1), 69 10.1186 / s12881-017-0423-6 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Ванга, Н. , Ванга, Л. , Ян, Х. , Чжан, Х. , Лан, Б. , Он, X. ,… Чен, К. (2015). Множественные генетические варианты связаны с риском колоректального рака в популяции ханьцев. Европейский журнал профилактики рака, 24 (1), 1–5. 10.1097 / CEJ.0000000000000012 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Ву, X. , Сцело, Г. , Пердью, М. П. , Ротман, Н. , Йоханссон, М. , Е, Ю. ,… Чанок, С.Дж. (2012). Полногеномное ассоциативное исследование идентифицирует новый локус восприимчивости к почечно-клеточной карциноме на 12p11.23. Молекулярная генетика человека, 21 (2), 456–462. 10.1093 / hmg / ddr479 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Сюн, Ю.М. , Мо, X. Y. , Zou, X. Z. , Сонг, Р. X. , Солнце, W. Y. , Лу, В. ,… Занг, В. Дж. (2010). Изучение ассоциации между полиморфизмом генов селенопротеинов и восприимчивостью к болезни Кашина-Бека. Остеоартрозный хрящ, 18 (6), 817–824.10.1016 / j.joca.2010.02.004 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Чжан, Ф. , Го, X. , Чжан, Ю. , Вэнь, Ю. , Ван, В. , Ванга, С. ,… Дэн, Х. В. (2014). Изучение вариаций числа копий в масштабе всего генома и анализ экспрессии генов идентифицируют ABI3BP как ген восприимчивости к болезни Кашина-Бека. Генетика человека, 133 (6), 793–799. 10.1007 / s00439-014-1418-4 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Чжан, Ф. , Вэнь, Ю. , Го, X. , Чжан, Ю. , Ван, X. , Ян, Т. ,… Дэн, Х.W. (2015). Полногеномное ассоциативное исследование идентифицирует ITPR2 как ген восприимчивости к болезни Кашина-Бека у китайцев хань. Артрит и ревматология, 67 (1), 176–181. 10.1002 / арт.38898 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Селен для профилактики остеоартропатии Кашина-Бека у детей: метаанализ