10 школа ирбит сайт: МАОУ «Школа № 10»

Патриотическая акция «Знамя Победы» прошла в Восточном управленческом округе Свердловской области
26 сентября 2020 года в поселке Зайково, в сквере Героев прошла региональная патриотическая акция «Знамя Победы», в ходе которой образовательным организациям и патриотическим клубам Восточного управленческого округа, добившимся значительных успехов в области патриотического воспитания, вручили копии Знамени Победы.
Организаторами региональной патриотической акции «Знамя Победы» являются Министерство образования и молодежной политики Свердловской области и государственное автономное учреждение Свердловской области «Региональный центр патриотического воспитания».
В торжественной церемонии приняли участие представители администрации Восточного управленческого округа, руководители Ирбитского муниципального образования, управления образования, управления культуры, ветеранских организаций, школьники из 13 муниципальных образований.
Участников акции приветствовали ведущий специалист по социальной политике администрации Восточного управленческого округа Боярская Юлия Владимировна, председатель Думы Ирбитского МО Врублевская Елена Николаевна и председатель Ирбитского Совета ветеран Вооруженных Сил Российской Федерации полковник в отставке Анатолий Иванович Клепиков
Обращаясь к собравшимся в сквере Героев землякам, выступающие напомнили, что 2020 год проходит под знаком 75-летия Победы советского народа в Великой Отечественной войне – Указом Президента Российской Федерации Владимира Владимировича Путина этот год в России объявлен Годом памяти и славы и подчеркнули, что, принимая копию Знамени Победы, молодое поколение, воспитанники патриотических организаций и школ Восточного управленческого округа, соприкасаются с историей военных лет и преклоняют головы перед подвигом защитников Отечества.
Копии Знамени Победы вручил начальник отдела Регионального центра патриотического воспитания, полковник запаса Артамонов Юрий Васильевич.
В Восточном управленческом округе вручения копии Знамени Победы удостоены 17 организаций, в это число вошло и наше образовательное учреждение – Муниципальное автономное общеобразовательное учреждение «Школа №1» Камышловского городского округа имени Героя Советского Союза Бориса Самуиловича Семёнова (директор – Вильд Светлана Анатольевна). На базе образовательного учреждения с 2004 года организованы кадетские классы, работает военно-патриотический клуб «Альфа», поисковой отряд «Искатель», юнармейский отряд, совет школьного музея. Более 10 лет учащиеся школы – участники областных акций «Помним, гордимся, наследуем», «Дорога к обелиску «Пост №1». Учащимися ведется поисковая деятельность с выездом в экспедиции, а также на портале «Память народа» по запросам жителей города. Школьники взяли шефство над захоронениями воинов и памятниками.
Напутствием всем участникам акции прозвучали слова начальника управления образования Ирбитского муниципального образования Черемисиной Надежды Вячеславовны, которая призвала ребят достойно хранить память предков, любить свою Родину, а если потребуется – умело защищать ее, как это делали старшие поколения россиян.
В завершение акции участники «Минутой молчания» почтили память всех погибших и умерших защитников Отечества.

На лыжной базе «Снежинка» прошло Первенство города Ирбита по лыжным гонкам среди сборных команд 10-11, 8-9, 5-7 классов

С 25 по 27 февраля 2020 года на лыжной базе «Снежинка» прошло Первенство города Ирбита по лыжным гонкам среди сборных команд 10-11, 8-9, 5-7 классов, посвященное Дню защитника Отечества, в рамках Спартакиады общеобразовательных школ Муниципального образования город Ирбит учебный год 2019-2020 гг.

Личное первенство 10-11 классы. Дистанция 3 км
Юноши
1 место Котельников Сергей (школа № 9) 9.01
2 место Дружинин Даниил (школа № 18) 9.17
3 место Бебенин Данил (школа № 10) 9.37

Девушки
1 место Киприна Екатерина (школа №13) 11.04
2 место Бессонова Карина (школа №8) 11.13
3 место Маркова Анастасия (школа №9) 13.31

Общекомандный зачет 10-11 классов
1 место команда школы №8
2 место команда школы №9
3 место команда школы №10

Личное первенство 8-9 классы. Дистанция 3 км
Юноши 8 классов
1 место Томилов Вадим (школа №8) 9.09
2 место Холкин Никита (школа №8) 9.39
3 место Мозырев Данил (школа №8) 11.52

Девушки 8 классов
1 место Замятина Анастасия (школа №8) 11.34
2 место Старкова Мария (школа №8) 11.56
3 место Старикова Юлия (школа №13) 13.09

Юноши 9 классов
1 место Зырянов Александр (школа №13) 9.15
2 место Беседин Степан (школа №8) 9.45
3 место Удинцев Михаил (школа №3) 9.48

Девушки 9 классов
1 место Антонова Дарина (школа № 10) 14.59
2 место Тюстина Дарья (школа № 8) 17.03
3 место Палкина Анастасия (школа № 10) 18.16

Общекомандный зачет 8-9 классов
1 место команда школы №8
2 место команды школы №10
3 место команда школы №18

Личное первенство 5-7 классы. Дистанция 1 км
Мальчики 5 классов
1 место Мурашов Максим (школа № 1) 04.30
2 место Ваганов Иван (школа № 18) 5.32
3 место Дурносов Роман (школа № 10) 6.10

Девочки 5 классов
1 место Лапина Ксения (школа №9) 4. 00
2 место Завьялова Дарья (школа №9) 10.12
3 место Буланова Валерия (школа №10) —-

Мальчики 6 классов
1 место Луми Никита (школа № 1) 3.27
2 место Суслов Илья (школа № 8) 3.57
3 место Завьялов Марк (школа № 8) 4.07

Девочки 6 классов
1 место Бунькова Ксения (школа №1) 4.17
2 место Щербакова Варвара (школа №8) 5.55
3 место Завьялова Елизавета (школа№8) 6.07

Мальчики 7 классов
1 место Бекарев Егор (школа №8) 3.47
2 место Иванов Стас (школа №13)3.48
3 место Сутягин Матвей (школа №10) 4.18

Девочки 7 классов
Макарова Ариадна (школа №1) 3.58
Котельникова Анна (школа №9) 4.15
Голышева Анастасия (школа №9) 5.22

Общекомандный зачет 5-7 классов
1 место команда школы №8
2 место команда школы №10
3 место команда школы №9

https://vk.com/album-148162413_273237902

Эй, детки! Отправьте свои вещи на орбиту.

Хотите заняться космической наукой? Вам больше не нужно быть профессиональным исследователем или даже взрослым, чтобы вывести свой эксперимент на орбиту. Новая программа под названием DreamUp предлагает школьным группам слоты на экспериментальных стойках Международной космической станции всего за 15 500 долларов за штуку, и вы можете использовать бонусные баллы по кредитной карте, чтобы покрыть расходы.

«Мы стремимся снизить барьеры для доступа к космическим исследованиям», – сказал Джеффри Манбер, управляющий директор NanoRacks, в пресс-релизе, анонсирующем эту программу. «Это двойная победа. Эта первая в своем роде платформа для пожертвований на студенческие эксперименты поможет создать для студентов опыт мирового уровня».

NanoRacks, которая уже помогла внедрить iPhone и задатки для шотландского виски в космос, сотрудничает с Фондом Конрада по программе DreamUp.

«Некоторые эксперименты нельзя проводить на Земле, потому что мы не можем« выключить »гравитацию, – сказала Нэнси Конрад, председатель фонда и вдова астронавта Аполлона Пита Конрада. «DreamUp, поддерживаемый нашим партнером NanoRacks, – это идеальная система« включай и работай », которая помогает нашим следующим великим новаторам участвовать в научных исследованиях, как никто другой».

говорят, что баллы American Express Membership Rewards могут быть включены в стоимость эксперимента по ставке 10 долларов за каждые 1000 использованных баллов. Программа DreamUp открыта для учащихся младших классов, старшеклассников и студентов колледжей из аккредитованных школ США.

Учитель, я сократил эксперимент

Концепция является продолжением серии экспериментов студентов, которые уже были доставлены на станцию ​​на платформах NanoRacks.Одним из ключевых участников проекта станет Вернер Вавкен, директор Института прикладной математики, науки и инженерии христианских школ долины в Сан-Хосе, Калифорния. Вавкен и его ученики провели эксперименты для космической станции и научили этому несколько других школ. так же.

Первый урок, которым Вавкен делится с другими школами, заключается в том, что заниматься космической наукой не так сложно, как кажется. «Я объясняю им это, и они думают, что я из космоса», – сказал он мне. “Но они действительно могут это сделать.Небо больше не предел ». Директор христианской средней школы

«Они придумали способ смешивать бетон в космосе объемом 16 кубических дюймов, и у них не было бюджета в 4 миллиона долларов», – сказал Вавкен. Эксперимент должен вернуться на Землю в следующем месяце на борту российского корабля «Союз», и затем студенты проанализируют, как невесомый бетон отличается от земного эквивалента на молекулярном уровне.

Другие школьные эксперименты были направлены на мониторинг роста растений, роста бактерий и порчи пищи в условиях микрогравитации.

«Возможность для студентов проводить небольшие эксперименты на МКС является мощным мотиватором в науке, технологиях, инженерии и математике», – заявила в пресс-релизе на этой неделе главный научный сотрудник НАСА Международной космической станции Джули Робинсон. «DreamUp предоставит возможность лучшим студентам всех социально-экономических уровней доставлять свои эксперименты на космическую станцию, а система NanoRacks позволяет проводить их без какого-либо влияния на другие исследовательские мероприятия. “

Революция продолжается

Стандартные исследовательские платформы NanoRacks, известные как NanoLabs, доставляются на космическую станцию ​​во время грузовых полетов. Астронавты НАСА подключают их к электросети и системе связи станции, а затем просто дают им поработать в течение 30 дней. Студенты получают возможность пообщаться с космонавтами и проверить результаты своего эксперимента.

«Это действительно революционно для подростков – придумывать это, создавать, тестировать и одобрять NanoRacks», – сказал Вавкен.

Следующий год может быть еще более революционным. «Мы учим детей, как спроектировать и запустить спутник с Международной космической станции», – сказал Вавкен. По его словам, устройство CubeSat размером 4 дюйма (10 сантиметров) с каждой стороны может быть отправлено на орбиту уже в феврале следующего года из японской лаборатории Кибо.

Вавкен признал, что стоимость 15 500 долларов была «немного дорогой», но он сказал, что проект может изменить правила игры для подростков, интересующихся математикой, естественными науками и инженерными науками. Он вспомнил случай с одним старшеклассником, который участвовал в космическом эксперименте, который он помог организовать. «В прошлом году она закончила учебу … и получила четырехлетнюю стипендию в Массачусетском технологическом институте», – сказал он. «Теперь я думаю, что это хорошая расплата для ребенка, который учится после школы».

Для получения дополнительной информации о программе DreamUp, включая регистрационную форму, перейдите на веб-сайт Conrad Foundation.

Но подождите … это еще не все.

Тем временем аэрокосмические эксперты и их корпоративные партнеры только что начали кампанию на Kickstarter для гражданского космического научного проекта под названием ArduSat.Они собирают пожертвования для покрытия ожидаемых затрат в размере 35 000 долларов на строительство CubeSat, который будет содержать более двух десятков датчиков для орбитальных наблюдений. «Как только цель финансирования будет достигнута, мы сможем приступить к подаче заявок на бесплатные запуски через различные программы NASA или ESA», – говорят руководители проекта.

Организаторы кампании заявляют, что ArduSat будет «первой открытой платформой, позволяющей широкой публике разрабатывать и запускать свои собственные космические приложения, игры и эксперименты, управлять бортовыми камерами, чтобы делать снимки по запросу, и даже транслировать персонализированные сообщения. обратно на Землю.«Если проект сдвинется с мертвой точки, сторонники Kickstarter получат первые возможности взять управление в свои руки по сниженной цене.

Discover Magazine заключил партнерское соглашение с ArduSat для проведения конкурса Discover Space Challenge, который предлагает идеи для инновационных экспериментов и игр. или приложений для работы на наноспутнике. Победившие члены команды будут награждены комплектом Team Development Kit, который может воплотить их идею в жизнь.

Заинтересованы? Для получения дополнительной информации ознакомьтесь с рассказом Фила Плейта в блоге Bad Astronomy, а также с книгой Эвана Акермана отчет в блоге DVICE.

Подробнее о наноспутниках:

Алан Бойл – научный редактор msnbc. com. Присоединяйтесь к сообществу Cosmic Log, поставив лайк на странице журнала в Facebook , подписавшись на @ b0yle в Twitter и добавив страницу Cosmic Log в свое присутствие в Google+. Вы также можете проверить «Дело о Плутоне», мою книгу о спорной карликовой планете и поисках новых миров.

IRBIT контролирует апоптоз, взаимодействуя с гомологом Bcl-2, Bcl2l10, и способствуя контакту ER-митохондрий

В настоящем исследовании мы продемонстрировали взаимодействие между IRBIT и гомологом Bcl-2, Bcl2l10.Эти два белка взаимодействуют с одним и тем же доменом IP ₃ R; но в то время как IRBIT взаимодействует с IP ₃ -связывающим карманом (Ando et al., 2006), Nrz, ортолог Bcl2l10 рыбок данио, как было показано, взаимодействует с разными остатками (Bonneau et al., 2014). Наши результаты подтверждают, что IRBIT и Bcl2l10 имеют разные сайты связывания в связывающем домене IP ₃ , и демонстрируют существование комплекса Bcl2l10-IRBIT на IP ₃ R. Домен Bh5 Bcl2l10 участвует во взаимодействии с IRBIT. и IP ₃ R, но две отдельные части IRBIT опосредуют взаимодействия с Bcl2l10 и IP ₃ R.IP ₃ BD структурирован как щель, на конце которой находится карман, связывающий IP ₃ (Bosanac et al., 2002). N-концевая часть IRBIT (остатки 1–104), вероятно, скрыта в IP ₃ BD, где она взаимодействует с карманом связывания IP ₃ . Мы предполагаем, что остальная часть белка проецируется за пределы щели, где находится Bcl2l10. Это позволяет остаткам 169-201 IRBIT связываться с доменом Bh5 Bcl2l10, который имеет структуру α-спирали; следовательно, мы можем предположить, что одна сторона спирали взаимодействует с IP ₃ R, а другая – с IRBIT.Эта ассоциация между IRBIT и Bcl2l10 может стабилизировать их взаимодействие с IP ₃ R, тем самым увеличивая их влияние на IICR.

Дефосфорилирование IRBIT в начале апоптоза, по-видимому, активно участвует в гибели клеток. IRBIT обладает сайтом связывания протеинфосфатазы-1 (PP1) выше его богатой серином области (рис. 3B), между остатками 40 и 44 (Devogelaere et al., 2007). Было показано, что этот сайт связывания дефосфорилирует остаток Ser68, но не остатки Ser71, Ser74 и Ser 77 (Devogelaere et al., 2007). Интересно, что PP1, как было показано, опосредует апоптоз посредством дефосфорилирования Akt (Thayyullathil et al., 2011) и pRb (Puntoni and Villa-Moruzzi, 1999; Wang et al., 2001). Более того, PP1 может дефосфорилировать и активировать Bh4-only белок Bad, чтобы вызвать апоптоз (Ayllón et al., 2000). Наконец, ингибирование PP1, как сообщается, защищает кардиомиоциты от индуцированного туникамицином апоптоза (Liu et al., 2014). Все эти исследования подчеркнули роль PP1 в индукции апоптоза, и мы можем предположить, что IRBIT является мишенью для PP1 в начале апоптоза.Однако, хотя дефосфорилирование Ser68 с помощью PP1 может предотвращать дальнейшее фосфорилирование Ser71, Ser74 и Ser77, маловероятно, что PP1 сам по себе объясняет дефосфорилирование этих остатков, наблюдаемое во время апоптоза. Анализ последовательности IRBIT выявил наличие мотива LxVP между остатками 271 и 274, который является сайтом связывания Ca ²⁺ / кальмодулин-зависимой фосфатазы, кальциневрина (Rodríguez et al., 2009; Slupe et al., 2013 ). Кальциневрин играет роль в апоптозе; в частности, он участвует в зависимом от Ca ²⁺ апоптозе, активируя только Bh4-белок Bad (Wang et al., 1999) и способствуя транслокации Drp-1 в митохондрии (Cereghetti et al., 2008, 2010). Необходимо провести дальнейшие эксперименты для изучения способности кальциневрина дефосфорилировать IRBIT, но вполне вероятно, что комбинированное действие PP1 и кальциневрина отвечает за дефосфорилирование IRBIT во время апоптоза.

Во время апоптоза IRBIT, по-видимому, действует, вытесняя Bcl2l10 из мембран ER, тем самым ингибируя его антиапоптотическую функцию. Однако, учитывая, что IRBIT взаимодействует с множеством других партнеров, мы не можем исключить вклад одного из этих взаимодействий в апоптоз.В частности, взаимодействие IRBIT с Ca ²⁺ / кальмодулин-зависимой киназой IIα (CamKIIα) также может играть роль в апоптозе. Действительно, было показано, что IRBIT ингибирует CamKIIα (Kawaai et al., 2015), который обладает эффектом, способствующим выживанию, поскольку он, в частности, способствует экспрессии Bcl-2 и ингибирует активность каспазы-2 (Nutt et al., 2005; Song et al. ., 2010; Wei et al., 2013). В связи с этим сообщалось, что ингибирование CamKII способствует апоптозу (Ma et al., 2009; Wei et al., 2015). Интересно, что что касается Bcl2l10, взаимодействие между CamKII и IRBIT не зависит от фосфорилирования IRBIT (Kawaai et al., 2015). Т.о., помимо его эффекта на Bcl2l10, дефосфорилирование IRBIT во время апоптоза может способствовать его взаимодействию с CamKII, поскольку он больше не может взаимодействовать с большинством других своих партнеров. Повышенное взаимодействие IRBIT с CamKII может привести к ингибированию CamKII и, таким образом, к стимулированию апоптоза.

IRBIT, по-видимому, участвует в образовании или стабилизации точек контакта между ER и митохондриями. На сегодняшний день механизмы, управляющие формированием этих структур, остаются в значительной степени неизвестными. Наши результаты предполагают, что взаимодействие между IRBIT и IP ₃ R может опосредовать эффект IRBIT на контакт ER-митохондрий (рис. 7D). Этот результат был совершенно неожиданным, поскольку IP ₃ R, по-видимому, не требуется для контакта ER с митохондриями. В самом деле, KO трех изоформ IP ₃ R в клетках DT40, как сообщается, не влияет на частоту и длину точек контакта (Csordás et al., 2006). Митофузин 2 (Mfn2), ГТФаза, участвующая в слиянии митохондрий, признано ключевым игроком в установлении контакта ER-митохондрии, поскольку его KO, как сообщалось, сильно влияет как на образование MAM, так и на перенос Ca ²⁺ . между двумя органеллами (de Brito and Scorrano, 2008).Однако это требование Mfn2 в настоящее время пересматривается, поскольку два независимых исследования пришли к выводу, что Mfn2 KO фактически увеличивает контакт между ER и митохондриями (Cosson et al., 2012; Filadi et al., 2015). В свете этого противоречия мы не можем полностью исключить возможность того, что роль IP ₃ R в формировании MAMs была упущена, в частности, когда мы принимаем во внимание тот факт, что IP ₃ R является частью, вместе с Grp75 и VDAC комплекса, который физически связывает ER и митохондрии (Szabadkai et al. , 2006). Весьма вероятно, что этот комплекс аналогичен комплексу, содержащему IRBIT и Bcl2l10 (рисунок 3G). Хотя нокдаун Grp75 изменяет перенос Ca ²⁺ между ER и митохондриями, роль комплекса IP ₃ R-VDAC в контакте ER с митохондриями четко не исследована (Szabadkai et al., 2006). Дополнительные эксперименты по переоценке роли этого комплекса и IP ₃ R в образовании MAM могут способствовать дальнейшему пониманию того, как IRBIT участвует в контакте ER с митохондриями.Дополнительная возможность заключается в том, что ИРБИТ взаимодействует с разными партнерами в МАМ. Действительно, многочисленные белки, такие как комплекс Fis1-Bap31 (Iwasawa et al., 2011), PERK (Verfaillie et al., 2012), комплекс VAPB-PTPIP51 (Stoica et al., 2014) и Drp-1 ( Prudent et al., 2015), как было показано, локализуются в MAM и регулируют контакт ER с митохондриями. IRBIT может затем связываться с некоторыми из этих белков, чтобы сформировать связывающий комплекс между ER и митохондриями.

Тот факт, что IRBIT S68A не способствовал контакту ER-митохондрий (рис. 7E), поднимает вопрос о влиянии дефосфорилирования IRBIT на стабильность точки контакта во время апоптоза.Действительно, можно предположить, что удаление IRBIT из MAM во время апоптоза может фенокопировать IRBIT KO и уменьшить контакт ER-митохондрии, тем самым уменьшая перенос Ca ²⁺ в митохондрии вместо его увеличения. Однако несколько исследований показали, что контакты ER-митохондрий увеличиваются во время апоптоза (Csordás et al., 2006; Verfaillie et al., 2012; Prudent et al., 2015). В частности, Drp-1 рекрутируется в точках контакта ER-митохондрий во время апоптоза (Prudent et al., 2015), и PERK также может быть задействован, поскольку его KO отменяет увеличение точек контакта ER-митохондрий во время апоптоза (Verfaillie et al., 2012). Наша гипотеза, таким образом, состоит в том, что до апоптоза фосфорилированный IRBIT способствует контакту ER-митохондрий и, таким образом, создает платформу для правильного апоптоза. После индукции апоптоза IRBIT дефосфорилируется и перемещается в цитозоль, но другие белки, такие как Drp-1 или PERK, также привлекаются к MAM, чтобы усилить контакт ER-митохондрии и затем компенсировать удаление IRBIT. В клетках IRBIT KO эти белки, вероятно, все еще рекрутируются, но поскольку контакты ER-митохондрии меньше, увеличения этих контактов недостаточно для обеспечения проапоптотического переноса Ca ²⁺ .

Наше настоящее исследование выявило новую функцию IRBIT как регулятора клеточной гибели благодаря его способности регулировать контакт ER-митохондрий и активность Bcl2l10. Интересно, что экспрессия IRBIT снижается в линии клеток рака яичников человека (Jeong et al., 2012). Поскольку Bcl2l10 высоко экспрессируется в яичниках (Guillemin et al., 2009; Inohara et al., 1998), мы можем предположить, что снижение экспрессии IRBIT в клеточной линии рака яичников приводит к повышенной активности Bcl2l10, что может способствовать к обычной устойчивости раковых клеток к апоптозу. Более того, недавно было показано, что IRBIT ингибирует рибонуклеотидредуктазу (RNR), фермент, который обеспечивает пул dNTP для репликации ДНК (Arnaoutov, Dasso, 2014). В раковых клетках высокая активность RNR необходима для доставки dNTP, необходимых для быстрой пролиферации клеток, а повышенная активность RNR часто наблюдается при раке (Aye et al., 2015). Таким образом, сниженная экспрессия IRBIT может способствовать устойчивости к апоптозу из-за повышенной активности Bcl2l10 и уменьшения контакта ER-митохондрий, а также, дополнительно, к пролиферации клеток, способствуя повышенной активности RNR.Эти наблюдения, связанные с тем фактом, что экспрессия IRBIT снижается в линиях раковых клеток, устойчивых к лекарствам, разрушающим ДНК (Wittig et al., 2002), подчеркивают ключевую роль IRBIT в онкогенезе и могут привести к новое определение ИРБИТ как опухолевого супрессора.

Как IRBIT, так и long-IRBIT связываются и координированно регулируют активность Cl – / HCO 3 – обменника AE2 посредством модуляции лизосомной деградации AE2

AE2 – новая молекула-мишень для белков семейства IRBIT

Мы попытались найти связывающие белки семейства IRBIT в клетках B16-F10 с использованием анализа коиммунопреципитации с антителами против IRBIT и L-IRBIT. Было обнаружено, что некоторые белки специфически осаждаются совместно с IRBIT или L-IRBIT (рис. 1A). Каждая полоса, обозначенная стрелкой или острием стрелок на SDS-PAGE, была проанализирована с помощью анализа LC-MS / MS, и идентифицированные белки перечислены в таблице 1. Среди них AE2, который был идентифицирован из соосаждения IRBIT (рис. 1A, закрытая стрелка), хорошо известна своим участием в миграции клеток и регуляции клеточного объема, и мы сосредоточили внимание на его взаимодействии с семейством IRBIT.

Белки семейства IRBIT связываются с AE2.( A ) Белки, связанные с IRBIT и L-IRBIT в клетках B16-BL6, полученных иммунопреципитацией с использованием антител против IRBIT и против L-IRBIT, соответственно, визуализировали с помощью окрашивания серебром. Полосы белка, указанные стрелками и стрелкой, обрабатывали для анализа ЖХ-МС / МС. ( B ) IRBIT с меткой FLAG или L-IRBIT с меткой FLAG трансфицировали в Т-клетки HEK 293 отдельно или вместе с AE2 с меткой HA. Каждый лизат, экспрессирующий каждую конструкцию (ввод), обрабатывали для иммунопреципитации указанным антителом (IP).Коиммунопреципитаты анализировали с помощью иммуноблоттинга с указанными антителами (IB).

Во-первых, для подтверждения связывания между AE2 и белками семейства IRBIT был проведен анализ коиммунопреципитации с использованием Т-клеток HEK 293, сверхэкспрессирующих HA-меченные AE2 и меченные FLAG белки семейства IRBIT. AE2 был соосажден либо с IRBIT, либо с L-IRBIT, и, наоборот, IRBIT и L-IRBIT были соосаждены с AE2 в той же степени (рис.1B), что указывает на то, что AE2 является молекулой-мишенью связывания как IRBIT, так и L-IRBIT.

Активность AE2 снижена в клетках с нокаутом L-IRBIT

Чтобы понять влияние IRBIT или L-IRBIT на функцию AE2, мы установили клетки с нокаутом семейства IRBIT, используя систему CRISPR / Cas9. Мы подтвердили отсутствие IRBIT или L-IRBIT в двух независимо установленных клонах. Неожиданно уровень экспрессии AE2 изменялся противоположным образом в каждой нокаутной клетке. То есть экспрессия AE2 была немного увеличена в клетках, нокаутированных по IRBIT; с другой стороны, он был значительно снижен в клетках с нокаутом L-IRBIT (рис.2А). Затем мы измерили активность AE2 в каждой нокаутной клетке. Активность AE2 выражалась внутриклеточным подщелачиванием при замене перфузирующего раствора с Cl ^– , содержащего один, на свободный от Cl ^– . В контрольных клетках (дикого типа) при использовании этого протокола наблюдали сильное ощелачивание, и ощелачивание отменялось в клетках с нокаутом AE2 (рис. S1A – C), что указывает на то, что ощелачивание в клетках B16-F10 полностью происходило из AE2. Активность AE2 в клетках, нокаутированных по L-IRBIT, была значительно снижена (рис.2Б). Мы заметили, что оба клона IRBIT KO показали небольшое увеличение исходного pHi и активности AE2, однако разница не достигла статистической значимости (рис. 2C).

Активность AE2 подавляется в клетках, нокаутированных по L-IRBIT, и эта активность восстанавливается за счет экзогенной экспрессии L-IRBIT. ( A ) Клетки с нокаутом IRBIT или L-IRBIT (KO) были созданы с использованием стратегии CRISPR / Cas9, и два независимых клона каждой линии клеток KO были проверены на экспрессию IRBIT, L-IRBIT и AE2 с использованием иммуноблота ( верхняя панель).Показан относительный уровень экспрессии AE2 в каждой KO-клетке по сравнению с контрольными клетками, N = 4 (нижняя панель). ( B ) Активность AE2 в клетках L-IRBIT KO исследовали путем измерения изменения внутриклеточного pH (ΔpHi) при замене перфузионного буфера с Cl ^–, содержащего, на свободный буфер Рингера Cl ^–, содержащий чувствительный к pH краситель SNARF1. Типичные графики изменения pHi, полученные для контроля (синий), L-IRBIT KO1 (красный) и L-IRBIT KO2 (оранжевый) (верхняя панель). Средняя активность AE2 (∆pHi / мин) каждого типа клеток составляла 0.21 ± 0,02 (WT), 0,13 ± 0,01 (L-IRBIT KO1) и 0,11 ± 0,01 (L-IRBIT KO2), N = 3 (нижняя панель). ( C ) Типичный график изменения pHi, полученный для контроля (синий), IRBIT KO1 (красный) и IRBIT KO2 (оранжевый) (верхняя панель). Активность AE2 составила 0,22 ± 0,04 (WT), 0,25 ± 0,04 (IRBIT KO1) или 0,27 ± 0,01 (IRBIT KO2), соответственно, N = 4 (нижняя панель). ( D ) Влияние экзогенной экспрессии L-IRBIT на активность AE2 в каждом типе клеток, WT, L-IRBIT KO1, L-IRBIT KO2 или двойной нокаут L-IRBIT / AE2 (DKO).Клетки, экспрессирующие L-IRBIT, отбирали на основе совместно экспрессируемых сигналов GFP. Синий график – это фиктивный контроль, а красный график – это L-IRBIT, экспрессирующие клетки WT B16 – F10 (верхняя левая панель), клетки L-IRBIT KO1 (верхняя средняя панель), клетки L-IRBIT KO2 (верхняя правая панель). и клетки с двойным нокаутом L-IRBIT / AE2 (нижняя левая панель). ( E ) Средняя активность AE2 каждого типа клеток составляла 0,15 ± 0,02 (WT + вектор), 0,20 ± 0,04 (WT + L-IRBIT), 0,10 ± 0,02 (L-IRBIT KO1 + вектор), 0,25 ± 0,02 (L -ИРБИТ КО1 + Л-ИРБИТ), 0.07 ± 0,01 (L-IRBIT KO2 + вектор), 0,21 ± 0,02 (L-IRBIT KO2 + L-IRBIT), 0,02 ± 0,01 (L-IRBIT / AE2 DKO + вектор), 0,03 ± 0,01 (L-IRBIT / AE2 DKO + L-IRBIT), N = 4. Общее количество клеток указано на каждом графике. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001, NS (нет значимости).

Чтобы подтвердить эффекты L-IRBIT KO на активность AE2, мы исследовали, восстанавливается ли активность AE2, когда L-IRBIT экзогенно экспрессируется в клетках L-IRBIT KO. Если L-IRBIT экзогенно экспрессировался в каждом клоне клеток L-IRBIT KO, активность AE2 значительно повышалась в обоих клонах L-IRBIT KO.Более того, когда L-IRBIT сверхэкспрессируется в контрольных клетках, активность AE2 немного увеличивается, и ни избыточная экспрессия, ни нокаут L-IRBIT не приводят к изменениям в AE2 KO клетках (рис. 2D и S1A-C). Эти результаты ясно показали, что потеря L-IRBIT в клетках B16-F10 снижает экспрессию AE2, что приводит к снижению активности AE2.

Связанные с AE2 клеточные процессы нарушены в клетках, нокаутированных по L-IRBIT.

AE2 участвует в восстановлении клеточного объема после гиперосмотической стимуляции, поглощая Cl ^– в клетки ¹⁹ . Чтобы оценить вклад L-IRBIT в регуляцию объема клеток путем регулирования активности AE2, мы исследовали восстановление объема клеток после гиперосмотической стимуляции с использованием метода тушения кальцеина ²⁰ . Восстановление объема клеток наблюдалось после изменения осмолярности перфузионных буферов с 300 до 450 мОсм в контрольных клетках; однако он почти исчез в клетках AE2 KO (рис. S1D), что указывает на то, что восстановление объема клеток, наблюдаемое в этих экспериментальных условиях, было связано с активностью AE2 (рис.S1E). В нокаут-клетках IRBIT скорость восстановления существенно не отличалась от таковой для контрольных клеток (фиг. 3A). С другой стороны, клетки с нокаутом L-IRBIT показали значительно сниженное восстановление клеточного объема (фиг. 3B). Эти результаты предполагают, что L-IRBIT может участвовать в регуляции клеточного объема посредством модуляции активности AE2.

Восстановление объема клеток после гипертонического стресса нарушено в клетках, нокаутированных по L-IRBIT. ( A ) Восстановление объема клеток IRBIT KO измеряли на основании изменения флуоресценции при замене перфузионного буфера с 300 мОсм буфера на 450 мОсм с использованием кальцеина-AM.Типичные графики изменения относительного объема клеток по сравнению с исходным уровнем, полученным для контроля (синий), IRBIT KO1 (красный) и IRBIT KO2 (оранжевый) (левая панель). Эффективность RVI каждого типа ячеек через 20 мин после замены буфера на 450 мОсм. Эффективность RVI (%) составила 34,6 ± 13,6 (WT), 46,7 ± 5,6 (ИРБИТ КО1), 30,0 ± 7,7 (ИРБИТ КО2), N = 3–4 (правая панель). ( B ) Восстановление объема клеток в клетках L-IRBIT KO измеряли, как указано выше. Типичный график относительного объема клеток из контроля (синий), L-IRBIT KO1 (красный) и L-IRBIT KO2 (оранжевый) (левая панель).Эффективность RVI каждого типа клеток составляла 41,8 ± 6,1 (WT), 9,7 ± 5,6 (L-IRBIT KO1), 13,3 ± 5,0 (L-IRBIT KO2). N = 3–4 (правая панель). ( C ) Были показаны результаты анализа заживления ран. Показаны репрезентативные микрофотографии монослоя раненых клеток (левая панель). Ширину раны измеряли в 6 положениях сразу после ранения и через 18 часов у WT, ИРБИТ КО (ИРБИТ КО1, ИРБИТ КО2) и Л-ИРБИТ КО (L-ИРБИТ КО1, L-ИРБИТ КО2), N = 4 (правая панель) . Общее количество клеток указано на каждом графике.* P <0,05, ** P <0,01, NS (нет значимости).

AE2 локализуется на переднем крае мигрирующих фибробластов, и его активность также необходима для миграции клеток ^21,22 . Таким образом, мы также исследовали миграцию каждой клетки KO, используя анализ царапин. Анализ проводили в условиях среды с пониженным содержанием сыворотки (0,5%), при которых не наблюдали значительного различия в скорости пролиферации среди клеток KO (фиг. S2A и B). Клетки AE2 KO показали меньшую миграцию по сравнению с контрольными клетками, что указывает на то, что AE2 участвует в миграции этих клеток меланомы (рис.S2C, D). Миграция клеток L-IRBIT KO (L-IRBIT KO1 и L-IRBIT KO2) была значительно снижена (рис. 3C), а двойной нокаут AE2 и L-IRBIT не оказал никакого влияния на миграцию клеток, что позволяет предположить, что эффект делеции L-IRBIT при миграции клеток опосредовано AE2. Напротив, клетки IRBIT KO показали аналогичную скорость миграции клеток по сравнению с контрольными клетками (фиг. 3C).

В совокупности клетки L-IRBIT KO показали снижение экспрессии AE2 и снижение связанных с ним клеточных функций, что указывает на специфическую потенциальную роль L-IRBIT в модулировании активности AE2.

L-IRBIT связывается с AE2 посредством прямого взаимодействия общего домена AHCY семейства IRBIT и N-концевой области AE2

Хорошо известно, что IRBIT связывается и активирует NBCe1B, продукт гена SLC4A4. В этом случае IRBIT напрямую связывается со специфической для сплайсинга N-концевой цитоплазматической областью NBCe1B ⁴ . AE2 также относится к семейству генов SLC4A (также обозначается как SLC4A2) и имеет структурные особенности, сходные с таковыми у NBCe1B ^23,24 . Таким образом, мы предсказали, что область, с которой связывается L-IRBIT, будет находиться в длинной цитоплазматической N-концевой области AE2, и мы провели анализ связывания коиммунопреципитации с использованием серии мутантов с N-концевой делецией AE2 (рис. 4A). ). Как показано на фиг. 4B, при делеции N-концевой области в диапазоне от 76-524 аминокислот L-IRBIT больше не связывается с удаленной формой AE2. L-IRBIT также не связывался с мутантами AE2, у которых отсутствует последовательность аминокислот 76–347. Мутант AE2, у которого отсутствует последовательность аминокислот 199-524, связывается с L-IRBIT в той же степени, что и AE2 дикого типа, что позволяет предположить, что сайт связывания находится в пределах 76-199 аминокислот.Однако мутант AE2, лишенный аминокислотной последовательности 76–198, все еще связан с L-IRBIT, но эта сила связывания была ниже, чем у AE2 без аминокислотной последовательности 199-524, что позволяет предположить, что на N-конце будут два отдельных сайта связывания L-IRBIT. AE2, а именно а.о. 76–199 и а.о. 199–347 (рис. 4А). В самом деле, если аа 199–347 удаляется из AE2, мутант проявляет гораздо более слабую силу связывания с L-IRBIT, чем AE2 дикого типа. Это означает, что аминокислотные остатки 348-524 могут вести себя как ингибиторная область для связывания L-IRBIT с аминокислотами 76-199, и что область аминокислот 199-347 может также играть роль супрессора опосредованного аминокислотами 348-524 ингибирования.

Кластер His в N-концевой области AE2 участвует во взаимодействии между AE2 и белками семейства IRBIT. ( A ) Схематическая диаграмма мутантов с делецией AE2, меченных GFP (верхняя панель). Выравнивание последовательностей N-концевых участков (а.о. 55–111 у мыши) различных видов AE2. Красные буквы обозначают кластеры основных аминокислот и обозначаются как His-кластер, 1-й кластер R / K и 2-й кластер R / K, соответственно. mAE2: мышь AE2, NM_009207.3; hAE2: человеческий AE2, NM_003040.4; cAE2: курицаAE2, NM_204963.1; zAE2: рыба данио AE2, NM_001037237.1 (нижняя панель). ( B ) L-IRBT с меткой FLAG трансфицировали только в Т-клетки HEK 293 или с помощью AE2 с меткой GFP. Лизат, экспрессирующий каждую конструкцию (ввод), обрабатывали для иммунопреципитации каждым указанным антителом (IP). Коиммунопреципитацию анализировали с помощью иммуноблотов с указанными антителами (IB) (левая панель). Эффективность связывания каждого усеченного мутанта AE2 с L-IRBIT рассчитывали на основе сигналов GFP коиммунопреципитированного / входящего сигнала.Относительная эффективность связывания каждого усеченного мутанта AE2 представлена ​​процентным соотношением AE2 дикого типа (100%), N = 3. * P <0,05, NS (нет значимости) (правая панель). ( C , D ) L-IRBIT с меткой FLAG трансфицировали в Т-клетки HEK 293, и лизат вытягивался каждым слитым белком с меткой GST, несущим указанную N-концевую область с мутациями AE2 или без них. Связанный L-IRBIT исследовали с помощью иммуноблоттинга и антител против FLAG. ( E ) HA-меченый AE2 дикого типа или мутант (аа 78-82) трансфицировали только в Т-клетки HEK 293 или с помощью семейства IRBIT, меченного FLAG.Лизат, экспрессирующий каждую конструкцию (ввод), обрабатывали для иммунопреципитации каждым указанным антителом (IP). Коиммунопреципитацию анализировали с помощью иммуноблотов с указанными антителами (IB).

NBCe1B имеет характерные кластеры положительно заряженных остатков в N-концевой области ²⁵ . Сообщалось, что IRBIT связывается и усиливает NBCe1B и что три консервативных остатка аргинина в N-концевой области важны для взаимодействия между IRBIT и NBCe1B ²⁵ .По аналогии с этими находками мы исследовали N-концевую последовательность AE2 и обнаружили кластеры основных остатков в AE2 мыши, которые консервативны среди различных видов (рис. 4A). Таким образом, мы сосредоточились на N-концевой области от аминокислот 1–198 и получили GST-слитые белки, несущие различные части N-концевых аминокислот 1–198 AE2, и исследовали взаимодействие между слитыми белками GST и полноразмерным FLAG- меченый L-IRBIT экспрессируется в Т-клетках HEK 293 с использованием анализа GST pull-down. Как и ожидалось, AE2-aa1-198 с GST-меткой связывался с L-IRBIT (рис.4С). GST-меченный AE2-aa1-111 связывается с L-IRBIT в той же степени, что и GST-меченный AE2-aa1-198, указывая тем самым, что аа 112–198 не участвует в связывании (Fig. 4C). AE2-aa1-111 действительно включает кластеры основных остатков, которые разделены на три части: кластер His, кластер 1-го Arg и кластер 2-го Arg (фиг. 4A). Чтобы выяснить, какая часть (части) является критической для связывания L-IRBIT, слитые белки GST-меченного AE2 были дополнительно усечены и исследованы на связывание с L-IRBIT. Нисходящий анализ продемонстрировал устойчивое связывание GST-меченного AE2-aa1-100 с L-IRBIT, предполагая, что 2-й кластер Arg не участвовал во взаимодействии, в то время как GST-меченный AE2-aa1-88 показал пониженное связывание ( Инжир.4D). Это говорит о том, что 1-й кластер Arg принимает активное участие во взаимодействии. При дальнейшем удалении слитые белки GST, либо GST-тегированный AE2-aa1-75, или GST-тегированный AE2-aa1-45, больше не связываются с L-IRBIT, что указывает на то, что кластер His необходим для взаимодействия (рис. 4D) . Критическое участие His-кластера во взаимодействии было подтверждено открытием, что GST-меченный AE2-aa55-88, который включает только His-кластер и его N-концевую фланкирующую область, продемонстрировал существенное связывание с L-IRBIT (рис.4D). Мы также исследовали важность His-кластера и 1-го кластера Arg для взаимодействия с точечными мутациями в основных остатках. В анализе методом pull-down оба мутанта GST-меченного AE2-aa 1–111, GST-меченного AE2-aa 78AAIAA82 и GST-меченного AE2-aa 93AAA95 показали значительно сниженное связывание с L-IRBIT, и это снижение было гораздо более очевиден в AE2-aa 78AAIAA82 с GST-меткой, чем в AE2-aa 93AAA95 с GST-меткой, что позволяет предположить, что кластер His имеет больший вклад во взаимодействие (рис.4D). Действительно, эксперименты по гетерологичной коэкспрессии и иммунопреципитации показали, что связывание полноразмерного AE2, мутированного в области aa 78-82, как с IRBIT, так и с L-IRBIT, было намного слабее по сравнению с связыванием AE2 дикого типа (Fig. 4E). Эти результаты показали, что для взаимодействия между AE2 и белками семейства IRBIT основные аминокислоты в N-концевой области AE2 важны для связывания с NBCe1B; однако остатки His в AE2 были более критичными, чем кластеры Arg.

Затем для определения области белков семейства IRBIT, ответственных за связывание AE2, была приготовлена ​​серия делеционных мутантов L-IRBIT с меткой FLAG (рис.5A) и были проверены на их связывание с полноразмерным AE2 в контексте гетерологичной экспрессии. Связывание между HA-меченным AE2 и полноразмерным FLAG-меченным L-IRBIT подтверждали с помощью анализов направленной коиммунопреципитации. Если делеция произошла в консервативной спиральной спирали семейства IRBIT плюс домен AHCY (помеченный FLAG L-IRBIT-aa1-184 на рис. 5B) или C-концевую часть домена AHCY (помеченный FLAG L-IRBIT-aa1 -307) связывание между HA-меченным AE2 и усеченным FLAG-меченным L-IRBIT больше не наблюдалось.Напротив, область LISN, специфическая для L-IRBIT часть придатка, была незаменима для связывания (L-IRBIT-aa107-610 с меткой FLAG), что согласуется с выводом о том, что как IRBIT, так и L-IRBIT обладают сопоставимой способностью связывания. к AE2, как указано выше. Еще одна усеченная по N-концу форма L-IRBIT с меткой FLAG [L-IRBIT с меткой FLAG (aa 185-610)], лишенная консервативных множественных сайтов фосфорилирования, необходимых для связывания с различными белками-мишенями, такими как IP ₃ R и NBCe1C ^2,4 , все еще связанный с AE2.Эти результаты предполагают, что для связывания белков семейства IRBIT с AE2 важна консервативная С-концевая область, включая область спиральной спирали и домен AHCY белков семейства IRBIT, и что фосфорилирование белков семейства IRBIT не является необходимым. нужно.

C-концевой домен AHCY белков семейства IRBIT напрямую взаимодействует с N-концевым участком AE2. ( A ) Схематическая структура белков семейства IRBIT и усеченных мутантов L-IRBIT с меткой FLAG.LISN: N-концевой домен, специфичный для длинного IRBIT; SER: богатая серином область; CC: область спиральной катушки; Домен AHCY: обозначен домен, подобный аденозилгомоцистеингидролазе. ( B ) HA-меченный AE2 дикого типа трансфицировали в Т-клетки HEK 293 отдельно или с помощью FLAG-меченного L-IRBIT дикого типа или с помощью мутантов с делецией L-IRBIT, меченных FLAG (аминокислотные остатки 1–184, аминокислотные остатки 1–307, аминокислотные остатки). 107–610 и 185–610 а.о.). Лизат, экспрессирующий каждую конструкцию (ввод), обрабатывали для иммунопреципитации с каждым указанным антителом (IP).Коиммунопреципитаты анализировали с помощью иммуноблотов с указанными антителами (IB). ( C ) Очищенный слитый белок MBP (MBP или L-IRBIT с меткой MBP) был извлечен с использованием очищенного слитого белка с GST (GST, GST-tagged-AE2 (aa 1–111) или GST-tagged-AE2 ( aa 78–82). Связанные белки исследовали с помощью иммуноблоттинга с антителом против MBP.

Чтобы подтвердить прямое и независимое от фосфорилирования связывание белков семейства IRBIT с AE2, мы приготовили очищенные белки, несущие каждую важную часть из E.coli и исследовали связывание с помощью эксперимента с понижением частоты. Контрольный белок, связывающий мальтозу (MBP), не подавлялся ни GST, ни GST-меченным AE2-aa1-111. Однако слитый белок MBP, несущий L-IRBIT-aa185-610, который не показал связывания с GST, был разрушен GST-меченным AE2-aa1-111 (фиг. 5C). GST-меченый AE2-aa1-111, мутировавший в Hiss to Alas (78AAIAA82), показал пониженное связывание с MBP-меченным L-IRBIT-aa185-610. Эти результаты ясно демонстрируют, что семейство IRBIT напрямую связывается с AE2 посредством взаимодействия между консервативным C-концевым доменом белков семейства IRBIT и N-концевой областью кластера His AE2.

Гомомультимер IRBIT способствует лизосомной деградации AE2, которая подавляется включением L-IRBIT в мультимер.

Как показано выше, AE2 является общей мишенью связывания из семейства IRBIT. Однако снижение уровня экспрессии и последующее снижение активности переносчика AE2 было обнаружено только в клетках с нокаутом L-IRBIT, но не в клетках с нокаутом IRBIT. Чтобы прояснить механизм, который объясняет несоответствие между связывающей способностью и функциональными свойствами IRBIT и L-IRBIT с AE2, мы установили клетки с двойным нокаутом IRBIT / L-IRBIT и измерили активность AE2 с помощью SNARF-1.Интересно, что активность AE2 в клетках с двойным нокаутом IRBIT / L-IRBIT была увеличена в 1,4 раза по сравнению с контрольными клетками (фиг. 6A). В соответствии с этим уровень экспрессии AE2 в клетках с двойным нокаутом IRBIT / L-IRBIT увеличивался параллельно (фиг. 6B), а миграция клеток с двойным нокаутом IRBIT / L-IRBIT была сопоставима с миграцией контрольных клеток (фиг. S2E – G). В совокупности результаты KO-клеток семейства IRBIT предполагают, что IRBIT может функционировать как негативный регулятор уровня экспрессии AE2 и что L-IRBIT служит эндогенным конкурентом IRBIT.Таким образом, мы попытались экспрессировать IRBIT или L-IRBIT в двойных KO-клетках и исследовали активность AE2. Как и ожидалось, если IRBIT экспрессировался в двойных KO-клетках, активность AE2 снижалась (фиг. 6C). Между тем, если L-IRBIT экспрессировался, активность AE2 не изменялась (фиг. 6C). Интересно, что клетки, экспрессирующие IRBIT и L-IRBIT, показали увеличение исходного pHi. Хотя механизм не был ясен, это могло быть связано с тем фактом, что семейство IRBIT имеет несколько целевых ионных транспортеров и проявляет различные действия по отношению к ним ¹⁴ .

IRBIT снижает стабильность и активность AE2. ( A ) Двойные KO-клетки IRBIT / L-IRBIT были созданы с использованием стратегии CRISPR / Cas9, и в клетках была измерена активность AE2. Репрезентативный график изменения pHi, полученный для контроля (синий), клона 1 IRBIT / L-IRBIT DKO (красный) и клона 2 IRBIT / L-IRBIT DKO (оранжевый) (левая панель). Средняя активность AE2 (ΔpH / мин) составила 0,17 ± 0,01 (WT), 0,26 ± 0,02 (ИРБИТ / L-ИРБИТ DKO1) и 0,24 ± 0,01 (ИРБИТ / L-ИРБИТ DKO2), N = 5 (правая панель).( B ) Экспрессию белков IRBIT, L-IRBIT и AE2 в двойных клетках DKO IRBIT / L-IRBIT проверяли с помощью иммуноблоттинга. ( C ) Анализировали эффекты экзогенной экспрессии IRBIT или L-IRBIT на активность AE2 в клетках IRBIT / L-IRBIT DKO. Клетки, экспрессирующие IRBIT или L-IRBIT, отбирали на основе сигналов, коэкспрессируемых GFP. Синий график – это контрольные клетки, красный график – это клетки IRBIT / L-IRBIT DKO, оранжевый график – это клетки IRBIT / L-IRBIT DKO, экспрессируемые с помощью IRBIT, а зеленый график – клетки IRBIT / L-IRBIT DKO, экспрессированные с помощью L. -IRBIT (левая панель).Средняя активность AE2 в каждом типе клеток составила 0,22 ± 0,04 (WT + вектор), 0,37 ± 0,03 (ИРБИТ / L-ИРБИТ ДКО + вектор), 0,24 ± 0,02 (ИРБИТ / L-ИРБИТ ДКО + ИРБИТ), 0,35 ± 0,02 (ИРБИТ / Л-ИРБИТ ДКО + Л-ИРБИТ), N = 4–5 (правая панель). Общее количество клеток указано на каждом графике. ** P <0,01, NS (нет значимости).

Хорошо известно, что белки семейства IRBIT образуют мультимер через С-концевой домен AHCY ¹¹ . Действительно, наш анализ коиммунопреципитации показал, что IRBIT и L-IRBIT существуют как гетеро-мультимеры (рис.1А и таблица 1). Уровень и активность экспрессии AE2 в клетках L-IRBIT KO, но не в клетках с двойным KO, были значительно снижены, что свидетельствует о том, что гомо-мультимер IRBIT может подавлять экспрессию AE2. Чтобы выяснить, происходит ли это подавление на уровне транскрипции, мы исследовали уровни мРНК AE2 в каждой KO-клетке с помощью ПЦР в реальном времени. Уровень мРНК AE2 был почти постоянным в каждой нокаутной клетке (рис. S3A, B). Это говорит о том, что гомо-мультимеры IRBIT могут влиять на стабильность белка AE2. Таким образом, затем мы исследовали влияние химических соединений на уровень белка AE2, используя бафиломицин A1 (125 нМ) и MG132 (20 мкМ), которые являются ингибиторами лизосомальной деградации или протеасомной деградации, соответственно.Как показано на фиг. 7A, уровень белка AE2 увеличивался в 1,5 раза в контрольных клетках, обработанных бафиломицином A1, но не в контрольных клетках, обработанных MG132. В клетках L-IRBIT-KO при обработке бафиломицином A1 уровни белка AE2 увеличивались в 2,2 раза и восстанавливались до контрольного уровня. Напротив, обработка MG132 не показала каких-либо изменений в уровнях белка AE2 в клетках L-IRBIT-KO, что позволяет предположить, что связывание гомо-мультимера IRBIT с AE2 облегчает деградацию AE2 через путь эндоцитоза / лизосомы.Обработка MG132 в клетках IRBIT / L-IRBIT double KO и IRBIT KO не показала увеличения уровней белка AE2; однако лечение бафиломицином снова увеличивало уровни белка AE2 в этих клетках. Это увеличение было в меньшей степени, чем в клетках L-IRBIT KO, что позволяет предположить, что AE2 может постоянно подавляться посредством IRBIT-независимого и зависимого от эндоцитоза / лизосом пути деградации.

IRBIT облегчает деградацию AE2 через путь лизосомной деградации, а включение L-IRBIT в мультимер подавляет деградацию AE2.( A ) Каждую из нокаутных клеток семейства IRBIT обрабатывали ДМСО, бафиломицином A1 (125 нМ) или MG132 (20 мкМ) в течение 3 часов (левая панель). Влияние соединений на уровень экспрессии AE2 в каждой клетке KO оценивали путем сравнения экспрессии AE2 в клетках, обработанных соединением, с таковой в контрольных клетках DMSO, которая представлена ​​как кратное увеличение, N = 5 (правая панель). ( B ) Уровень экспрессии AE2, экзогенно экспрессируемого в клетках IRBIT / L-IRBIT DKO, исследовали, когда IRBIT и / или L-IRBIT совместно экспрессировались с другим соотношением комбинаций.Уровни экспрессии AE2, IRBIT и L-IRBIT оценивали с помощью иммуноблота с антителом против НА (AE2) и антителом против FLAG (IRBIT и L-IRBIT). «-», «+», «⧺» указывают количество каждой плазмидной ДНК, использованной для трансфекции. Показан относительный уровень экспрессии HA-меченного AE2, N = 3 (нижняя панель). ( C ) Исследовали уровень экспрессии мутантного AE2 (а.о. 78–82) в клетках IRBIT / L-IRBIT DKO, коэкспрессируемых с FLAG-меченным IRBIT или L-IRBIT. Показан относительный уровень экспрессии мутантного HA-меченного AE2, N = 3 (нижняя панель).( D ) Исследовали связывание мультимеров белков семейства IRBIT с AE2. GFP-меченный AE2 дикого типа трансфицировали в клетки IRBIT / L-IRBIT DKO с помощью HA-меченного IRBIT и / или меченного FLAG L-IRBIT. Лизат, экспрессирующий каждую конструкцию (вход), обрабатывали для иммунопреципитации каждым антителом против НА или антителом против FLAG (IP). Коиммунопреципитаты анализировали с помощью иммуноблоттинга с указанными антителами (IB). * P <0,05, NS (нет значимости).

Для непосредственного изучения эффектов гомомультимеров IRBIT на стабильность белка AE2, AE2 и IRBIT были экзогенно экспрессированы в двойных нокаутированных клетках IRBIT / L-IRBIT с постепенным увеличением экспрессии IRBIT.Уровень экспрессии AE2 снижался, так как уровень экспрессии IRBIT увеличивался (фиг. 7B). С другой стороны, уровень экспрессии AE2 не изменялся или скорее повышался, если L-IRBIT экспрессировался экзогенно (фиг. 7B). Кроме того, снижение экспрессии AE2, вызванное экспрессией IRBIT, было устранено совместной экспрессией L-IRBIT, что указывает на то, что связывание гомомультимера IRBIT облегчает деградацию AE2, которая ингибируется сосуществованием L-IRBIT (рис. 7Б). Мутант AE2 (аминокислотные остатки 78–82), показывающий пониженное связывание с IRBIT, не подвергался влиянию на уровень его экспрессии, если он коэкспрессировался с IRBIT или L-IRBIT в двойных нокаутных клетках IRBIT / L-IRBIT, что позволяет предположить, что деградация AE2 действительно был индуцирован связыванием IRBIT (рис.7С). В отличие от открытия, что экспрессия полноразмерного L-IRBIT в клетках L-IRBIT KO спасала активность AE2 (рис. 2D), экспрессию мутантных белков семейства IRBIT, лишенных связывания с AE2, IRBIT (aa 1–227) или L-IRBIT ( aa 1–307), не вызывали каких-либо изменений активности AE2 (рис. S4A, B), предполагая, что эффекты семейства IRBIT на стабильность и активность AE2 опосредованы прямым связыванием. Более того, если IRBIT или L-IRBIT был иммунопреципитирован из клеток с двойным нокаутом IRBIT / L-IRBIT, экзогенно экспрессируемых с AE2, было продемонстрировано, что IRBIT и L-IRBIT образуют гетеро-мультимеры, которые связываются с AE2 в той же степени, что и гомомультимеры IRBIT или Гомо-мультимеры L-ИРБИТ (рис.7D), предполагая, что включение L-IRBIT в мультимеры уменьшило деградационное действие гомомультимеров IRBIT.

Все эти данные предполагают, что связывание гомо-мультимера IRBIT способствует эндоцитозу / лизосомозависимой деградации AE2 и что L-IRBIT играет роль доминирующего негативного регулятора действия IRBIT.

Сиднейского католического управления образования Учащиеся школ расширяют круг читателей

Sydney Catholic Education Office (SCEO) рады предоставить учащимся новый привлекательный интерфейс для своей библиотеки Oliver v5.

Новый интерфейс Orbit ‘был разработан специально для учеников младших и средних школ и оказался вдохновляющим инструментом для юных читателей.

Orbit позволяет учащимся персонализировать домашнюю страницу своей библиотеки, используя различный фон, аватары и цветовые схемы.

Сиднейский католический отдел образования, менеджер библиотечных информационных служб Джон О’Брайен сказал, что отзывы школ SCEO, использующих Orbit, были отличными.

Студентам нравится иметь возможность настраивать домашнюю страницу своей собственной библиотеки, это делает работу всей библиотеки более интересной », – сказал Джон.

Softlink Натан Годфри сказал, что в Orbit легко ориентироваться учащимся младших и средних школ, но он предлагает расширенные функции и возможности, которые помогут им максимально эффективно использовать свою коллекцию школьных книг и ресурсы знаний.

Orbit предлагает технологии последнего поколения и был разработан с нуля для планшетов и iPad, что делает доступ студентов к Orbit действительно простым в любом месте и в любое время.

Студенты могут искать в своем библиотечном каталоге из дома и даже брать и загружать электронные книги из интерфейса Orbit, – сказал Натан.

С помощью Orbit школы могут включать автоматизированную карусель рекомендуемых книг или ресурсов.

Джон О’Брайен сказал, что, когда Сиднейское католическое управление образования развернуло Orbit, они создали книжную карусель, в которой были представлены заголовки из списка для чтения премьер-министра для 1–6 классов, но отдельные школы могут создавать или редактировать свои собственные карусели.

Замечательно иметь возможность показывать эти книги и поощрять чтение для удовольствия с раннего возраста ».

Студенты также могут создавать и публиковать обзоры книг и читать обзоры, опубликованные их сверстниками.

Он обеспечивает более интерактивный библиотечный опыт для студентов, преподавателей и сотрудников библиотеки, – сказал Джон.

Orbit – одна из ряда интересных новых разработок, выпущенных для Oliver v5 за последние двенадцать месяцев.

С Oliver v5 и Orbit мы предоставляем передовые технологии для обучения как сейчас, так и в будущем, – сказал Джон.

Orbit установлена ​​во всех 149 школах Сиднейского католического управления образования архиепископии.

Чтобы узнать больше, посетите www.softlinkint.com/oliver/orbit/

О офисе католического образования Сиднея

Управление католического образования (генеральный директор) Сиднея отвечает за руководство, эффективное функционирование и управление общими школами, в которых обучаются более 69 000 учащихся в 149 приходских начальных и региональных средних школах в Архиепископии Сиднея. Генеральный директор через свои центральные и три региональных офиса предоставляет школам широкий спектр услуг и ресурсов, которые были разработаны в консультации с директорами и учителями.Он работает со школами в реализации текущего Стратегического плана совершенствования, основанного на силе ». Основное внимание генерального директора уделяет поддержке школ и обеспечению каждому учащемуся качественного католического образования.

О Softlink

Softlink – ведущий мировой разработчик решений для управления знаниями, контентом и библиотеками, поддерживающий более 10 000 образовательных, государственных и общественных организаций и библиотек в 108 странах. Ведущее образовательное решение Softlink, Oliver v5, представляет собой интегрирующую и функционально богатую, полностью настраиваемую платформу для управления активами цифрового и физического обучения, их обнаружения и доставки.Softlink базируется в Австралии, Великобритании, Америке и Новой Зеландии. Softlink поддерживает австралийскую образовательную индустрию в течение 30 лет.

LTG Номер библиографической записи: 20355. Создано: 14.02.2015 07:14:12; Последнее изменение: 14 февраля 2015 г., 07:15:13.

OC СТАРШИЕ ШКОЛЬНИКИ ДЕЛАЮТ ИСТОРИЮ

10 ноября и 3 декабря 2018 года студенты, преподаватели и сторонники программы Irvine CubeSat STEM отметили две важные вехи на пути студентов к сборке, тестированию и запуску своих наноспутников на орбиту.Благодаря успешным запускам это первая программа по запуску двух спутников CubeSat, построенных учащимися старших классов, на орбиту менее чем за год.

Программа Irvine CubeSat STEM (ICSP) – это результат сотрудничества между Irvine Public Schools Foundation (IPSF) , Объединенным школьным округом Ирвина и Объединенным школьным округом Тастина (TUSD), чтобы обучать и вдохновлять новое поколение специалистов STEM. Он состоит из студентов шести различных средних школ (Бекман, Ирвин, Нортвуд, Портола, Университет и Вудбридж) в городе Ирвин, штат Калифорния, и финансируется за счет пожертвований через Фонд государственных школ Ирвина.

«То, что начиналось как безумная идея изменить способ обучения студентов STEM, превратилось в одну из самых прогрессивных космических программ для старших классов в стране и поистине бесценный опыт для всех участников», – Неда Итон, президент и генеральный директор, Фонд государственных школ Ирвина. «За последние два года наши студенты столкнулись с множеством реальных препятствий, которые помогли им лучше понять аэрокосмическую промышленность. Они решительно справились с этими проблемами, и мы очень гордимся их усердием и преданностью этой программе.”

Программа Irvine CubeSat STEM направлена ​​на предоставление образовательных ресурсов STEM для старшеклассников с целью вдохновить следующее поколение мыслителей-новаторов. В этой внеклассной программе также делается особый упор на создание возможностей для недостаточно представленных групп в областях, связанных с STEM, включая женщин и меньшинства. Этот проект является первым в своем роде в Калифорнии и первой программой средней школы на Западном побережье, в которой запущен на орбиту действующий спутник CubeSat.

IRVINE01 ЗАПУСК
Студенты упаковали готовый спутник CubeSat при запуске интегратора, Tyvak Nano-Satellite Systems, Inc., мирового лидера в области наноспутников, прежде чем их доставили на стартовую площадку в Новой Зеландии. Пусковая миссия «Пришло время для бизнеса» знаменует собой первый коммерческий запуск инновационной ракеты Electron в Хантингтон-Бич. Партнерство с этой местной компанией предоставило студентам возможность узнать о производстве ракеты-носителя Electron из первых рук.

Irvine01 вылетел в 19:50. PST от Rocket Lab Launch Complex 1 в Новой Зеландии, единственного в мире частного и управляемого орбитального стартового комплекса. После запуска студенты из группы связи отслеживали орбитальную траекторию спутника и установили радиосвязь с CubeSat, подтвердив, что он достиг орбиты и функционирует должным образом. На борту Irvine01 – камера с низким разрешением, которая будет делать снимки Венеры, ярких звезд и других небесных объектов. Данные этих изображений можно использовать для расчета расстояний до планет и определения точности наведения спутника.

IRVINE02 ЗАПУСК
Irvine02 запущен в космическом полете НАСА 3 декабря 2018 года в 10:32 из Ванденберга, Калифорния. Это была первая полностью специализированная миссия Spaceflight, получившая название «SSO-A: SmallSat Express» на борту ракеты Falcon 9 с базы ВВС Ванденберг в Калифорнии в конце этого года. SSO-A особенно важен, потому что это самая крупная миссия с участием более 70 спутников с американской ракеты-носителя.

Теперь, когда IRVINE02 успешно вышел на свою орбиту, студенты будут работать, чтобы установить с ним контакт для загрузки изображений и данных. Второй CubeSat программы предназначен для обучения оптической связи, передавая данные с орбиты на Ирвин с большей скоростью, чем радио. Студенты завершили строительство наземного оптического приемника и окуляра (OGRE) в средней школе Вудбриджа, который сможет принимать луч от IRVINE02, что приведет к более быстрой загрузке научных данных и предоставит студентам дополнительные возможности для участия во всех аспектах исследования. миссия.

НАСА И НЕ ТОЛЬКО

Irvine02 и Irvine03, следующая миссия программы Irvine CubeSat STEM, были отобраны для участия в программе НАСА по запуску CubeSat для выполнения предстоящих миссий, спонсируемых НАСА. Программа Irvine CubeSat STEM – одна из немногих групп под руководством старших классов, выбранных НАСА для участия в этой престижной программе наряду с университетами и исследовательскими центрами мирового уровня.

Участие в программе ELaNa позволило студентам работать вместе с профессионалами отрасли из НАСА и командами по интеграции ракет-носителей в космическом полете в Сиэтле, что дало студентам бесценный практический опыт и практическое обучение.

Программа Irvine CubeSat STEM была усилена за счет начального финансирования Фонда государственных школ Ирвина (IPSF), чтобы помочь начать эту многолетнюю инициативу STEM. В течение последних трех лет IPSF продолжал выполнять свои обязательства по сбору средств и управлению программой каждый год. Обычно такую ​​программу можно увидеть в НАСА или в нескольких элитных колледжах и университетах. Среди других корпоративных спонсоров – Фонд Арнольда и Мейбл Бекман, Cisco, FivePoint, Google, Ingersoll-Rand / Trane, MEGGiTT Defense Systems, Inc., Microsemi и Resilient. Помимо финансирования, IPSF обеспечивает надзор, консультации, организацию мероприятий и административную поддержку программы.

«Для нас большая честь поддерживать усовершенствованные инновации в классах в школах Ирвина, и мы очень благодарны нашим партнерам, которые разделяют нашу страсть и поддерживают эту программу с самого начала, помогая нашим ученикам достичь звезд», – говорит Итон.

Для получения дополнительной информации посетите http://www.ipsf.net/cubesat .

Домашняя страница – Школьный журнал

Просмотр обратного отсчета

Возраст 7–9 годы

Countdown – это литературная сокровищница, которая вдохновляет и увлекает новых независимых читателей.

Просмотр взрыва

Возраст 9–10 годы

Blast Off волнует и восхищает любознательных и независимых читателей, закрепляющих их знания английского языка.

Обзор орбиты

Возраст 10–11 лет годы

Orbit захватывает воображение опытных читателей созданными текстами и увлекательными иллюстрациями.

Просмотр приземления

Возраст 11 + годы

Touchdown предоставляет широкий спектр текстов, позволяя способным читателям исследовать захватывающий мир литературы.

школьных групп | АрселорМиттал Орбита

ArcelorMittal Orbit – идеальное место для школьных групп любого возраста. Позвольте вашим ученикам насладиться захватывающими видами с 80-метровых смотровых площадок или позвольте им бросить вызов своим одноклассникам на 40-секундный спуск по самому высокому, самому длинному и быстрому туннельному спуску в мире.

Ученики могут приблизиться к достопримечательностям Лондона с инновационными и интерактивными сенсорными экранами, которые позволяют им увеличивать масштаб и узнавать больше о городе, а также погрузиться в коллекцию характерных лондонских звуков, воспроизводимых через динамики, на пути вниз по 455 ступеням извилистый путь вокруг скульптуры.

В зависимости от их возраста, потребностей и способностей мы предлагаем вам возможность организовать лучший день для вашей группы на удивительной территории Олимпийского парка Королевы Елизаветы.

COVID-SECURE

Ваша безопасность – наш главный приоритет, поэтому мы приняли специальные меры, чтобы сделать это место безопасным для COVID. Все посетители должны носить маскировку в помещении и кататься на горке. По прибытии будет проводиться неинвазивная проверка температуры, а подъем на смотровые площадки возможен только для всех гостей.Оказавшись внутри, вы пройдете через одностороннюю систему, чтобы максимально дистанцироваться от общества. Каждую ночь на всей территории отеля проводится глубокая уборка, а в течение дня убираются «особо удобные» участки. Защитное снаряжение Slide, такое как шлем и налокотники, дезинфицируется между каждым использованием, и на всей территории есть станции для дезинфекции рук.

ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ СОДЕРЖАНИЕ

Мы предлагаем учителям ряд бесплатных образовательных ресурсов, специально разработанных для того, чтобы студенты могли учиться вне класса.Наша цель – предоставить образовательный и развлекательный опыт. Эти ресурсы, которые можно загрузить с нашего веб-сайта (см. Ниже), охватывают ключевые этапы 1–4 по ряду предметов, включая науку, географию, искусство и дизайн.

Дополнительные бесплатные образовательные ресурсы и туристические маршруты доступны на веб-сайте Олимпийского парка Королевы Елизаветы. Парк часто называют новейшей классной комнатой на открытом воздухе в Лондоне, и здесь есть множество возможностей настроить свой день в соответствии с вашими образовательными потребностями и учебной программой.

КОМБИНИРОВАННЫЕ БИЛЕТЫ

ГОРЯЧЕЕ БЛЮД НА ПОСЛЕДНЕЙ КАПЛИ

The Last Drop, расположенном прямо напротив ArcelorMittal Orbit, есть несколько вариантов меню, разработанных специально для школ. Мы предлагаем комплексное школьное меню, включающее основное блюдо, десерт и сквош всего по цене от 7,95 фунтов стерлингов.

ЭКСКУРСИЯ ПО ОЛИМПИЙСКОМ ПАРКУ КОРОЛЕВЫ ЕЛИЗАВЕТЫ

Пусть ваши ученики узнают, как этот район был преобразован для проведения Олимпийских игр 2012 года в Лондоне и что его ждет в будущем.Прогуляйтесь мимо красивых садов и водных путей, Лондонского стадиона, Лондонского центра водных видов спорта, арены Коппер Бокс и Велопарка Ли Вэлли. Прогулки проходят под руководством профессиональных гидов с Голубым значком. Также доступны серии тематических прогулок.

ЭКСКУРСИЯ ПО ЛОНДОНСКОМУ СТАДИОНУ

Экскурсия по Лондонскому стадиону содержит множество информации, аудио и видео, которые можно использовать в качестве образовательного инструмента для повышения ценности вашей школьной поездки. Школьные группы смогут посетить место проведения Олимпийских игр 2012 года в Лондоне и узнать, как стадион был преобразован в новый дом британской легкой атлетики и Вест Хэм Юнайтед.

ЗДЕСЬ

СХЕМА ПУТЕШЕСТВИЯ ДЛЯ ШКОЛЫ TFL

АрселорМиттал Орбита является зарегистрированным местом проведения программы TFL School Party Travel Scheme. Чтобы узнать, может ли ваша школа воспользоваться БЕСПЛАТНЫМИ групповыми поездками в непиковое время, посетите веб-сайт TFL.

ПУТЕШЕСТВИЕ

Для автобусов выделены точки посадки и посадки в 5 метрах от аттракциона. Стоянка для автобусов расположена на первом этаже многоэтажной автостоянки в северной части Олимпийского парка Королевы Елизаветы, недалеко от Уотерден-роуд.