132 школа екб: Школа № 132 Екатеринбург – сайт, отзывы

Сайт: школа132.екатеринбург.рф

Номер телефона: 8 (343) 258-42-52

Расположение на карте

Время работы

Отзывы

Обожаю эту школу! 132-ван лав!

5 месяцев назад

7 месяцев назад

11 месяцев назад

10 месяцев назад

Популярные места из категории Средняя школа

Участок №1253

Екатеринбург – Места | Страница 132

Административный центр Свердловской области.

Кума, салон красоты в Екатеринбурге на Малышева, 132 — отзывы, адрес, телефон, фото — Фламп

Хожу в данный салон не только на маникюр но и на уход для волос. Нравится что есть всегда свободные окошки,можно записаться день в день или на след.день.

Но в этом же есть и минус!

Ты всегда попадёшь к разным мастерам , в данной сети оказывается это плохо!

Ведь тут редко найдёшь мастера по маникюру, который сделать хотя бы просто хорошо!…

Показать целиком

Хожу в данный салон не только на маникюр но и на уход для волос. Нравится что есть всегда свободные окошки,можно записаться день в день или на след.день.

Но в этом же есть и минус!

Ты всегда попадёшь к разным мастерам , в данной сети оказывается это плохо!

Ведь тут редко найдёшь мастера по маникюру, который сделать хотя бы просто хорошо!

Сначала меня записали к мастеру стажеру, не сказав мне о том что она «стажёр» ( если бы я знала,не тратила бы своё время зря). Отправив фото администратору,о том какой ужас мне сделали,девушка вежливо предложила переделать его.

«Кстати видно что руководство клиентоориентированно, потому что всегда вежливо общаются, и видя результат предлагают переделать.»

Дальше больше!

Мне переделала другая мастер маникюр , не идеально ну и ладно , я уж подумала я придирчива. Потом я пошла к другому мастеру в эту же сеть салона, топ мастер – отличные отзывы – сделала маникюр где по всем пальцам затикает топ(. Ну как так то, опять пишу администратору,записываюсь и мне переделывают.

Через несколько дней переделанные ногти слоятся,опять перезаписываюсь на переделку, все терпимо.

В последний раз я решила дать этому салону шанс и записалась на 22 августа . Сделала мне другая девушка маникюр.

Боже мооой 🤦🏼‍♀️ При том что она переделывала мне два пальца, да там надо было все переделывать. В этот раз как и в те – выравнивания нет,все волной ( мои ногти не волнистые) не знаю как так можно покрывать. Под кутикулу не брежно все залито! Я уже устала от некачественной услуги в этом салоне. Подруги как не попросят посмотреть,мне стыдно показывать маникюр. Серьезно, такое ощущение что девушки домушники делают лучше, ведь я хожу в салон именно за качественной услугой! Воообщем нет сил больше тратить на вас время и деньги,данная услуга стоит 500 руб максимум, но не 950. Лучше доплатить 500р и получить качественный идеальный маникюр,и ходить довольной.

Последнее что хочу отметить – все девушки которые мне делали маникюр добрые, вежливые и приятные. Поэтому я не выложу фото работ с этим позором. Но я думаю по этой истории вы поймёте кто ее написал.

«IT Школа Samsung» подводит итоги 2020-2021 учебного года

Образовательный проект компании Samsung Electronics «IT Школа Samsung» завершил очередной учебный год. Выпускниками программы стали более 500 школьников, 15,2% из которых освоили программу на «отлично».

Результаты учебного года были подведены на 54 площадках «IT Школы Samsung», действующих по всей России, в том числе в городах Москва, Санкт-Петербург, Екатеринбург, Новосибирск, Арзамас, Благовещенск, Великий Новгород, Владикавказ, Волгоград, Вологда, Воронеж, Ижевск, Иркутск, Казань, Канаш, Курск, Липецк, Махачкала, Миасс, Москва, Новороссийск, Омск, Ростов-на-Дону, Рязань, Самара, Смоленск, Ставрополь, Стерлитамак, Сыктывкар, Тверь, Томск, Уфа, Хабаровск и Челябинск.

В июне на площадках проекта по всей России прошли защиты выпускных проектов. К концу учебного года выпускники программы «IT Школа Samsung» самостоятельно разработали мобильные приложения для Android на языке Java. Темы проектов ребята выбирали сами. Школьники любят создавать не только игры, но и задаются более серьезными вопросами. Например, как с помощью мобильных приложений организовать волонтерскую помощь, изучить английский язык или общаться с учениками своего IT-Куба. А еще смартфон в их проектах может быть частью технической системы для управления климатом в помещении, сценическим освещением, телесуфлером и даже инкубатором.

Обучение по программе было непростым, но интересным: по результатам анкетирования выпускников, 60% из них тратили на самостоятельную подготовку к урокам более 3 часов в неделю. Самым интересным опытом для учеников стала разработка собственного проекта. В итоге, 70% оценили занятия в «IT Школе» на «отлично», а 28,5% – на «хорошо».

Большинство выпускников намерены продолжать заниматься технологиями и в будущем: 85% планируют поступать на IT-направление в вузы, а 86% отмечают, что их интерес к сфере IT и программирования вырос за проведенный в «IT Школе Samsung» учебный год. Практически все, 98%, рекомендуют программу своим друзьям и знакомым.

«Мы постоянно развиваем проект “IT Школа Samsung”, чтобы отвечать самым актуальным мировым трендам технологического образования и готовить новых востребованных специалистов. Приятно, что 98% выпускников готовы рекомендовать нашу программу – это самый лучший показатель качества и подтверждение того, что мы движемся в верном направлении. Я также хочу поблагодарить преподавателей проекта за их высоко профессиональную работу в течение года», – отметил Сергей Певнев, директор по корпоративным проектам и взаимодействию с органами государственной власти штаб-квартиры Samsung Electronics по странам СНГ.

«IT Школа Samsung» ориентирована на получение знаний и практических навыков в сфере программирования школьниками 9-10 классов, имеющих склонность к алгоритмическому мышлению, увлекающихся IT-технологиями и обладающих устойчивыми знаниями по школьному курсу информатики и математики. Учащиеся программы «IT Школа Samsung» изучают разработку мобильных приложений на языке программирования Java для платформы Android. Школьники определяются с выбором будущей профессии и реализуют себя в области информационных технологий – ключевом направлении развития экономики страны.

Ежегодно в рамках федеральной социально-образовательной программы по подготовке будущих IT-специалистов «IT Школа Samsung» бесплатное обучение проходят более 1500 старшеклассников. Курс рассчитан на один учебный год (132 академических часа): по 4 академических часа групповых занятий с преподавателем в неделю. Занятия проводятся в формате дополнительного образования.

Выпускники «IT Школы Samsung» могут указать сертификат об окончании курса как достижение в компетенции «Решение комплексных инженерных задач», чтобы получить дополнительный бонус к баллам ЕГЭ при поступлении в ведущие технические вузы страны. Кроме того, учитываются конкурсы «IT Школа выбирает сильнейших – 2020» и «Конкурс предпрофессиональных умений.

ВОВЛЕЧЕНИЕ РОДИТЕЛЕЙ И ВОСПРИЯТИЕ УЧИТЕЛЕЙ

132 Hammertown Rd, Монро, Коннектикут 06468 | MLS # 170365845

Жилой на одну семью

• Включенная техника: электрическая плита, духовка, настенная духовка, микроволновая печь, морозильная камера, посудомоечная машина, стиральная машина, сушилка
• Количество каминов: 2
• In Law Квартира: Да
• In Доступ по закону: Первый этаж
• Элементы интерьера: Кабель – Готовая проводка

• Количество комнат: 11
• Дополнительные комнаты: фойе, грязевая комната
• Прачечная Расположение: основной уровень
• Информация о прачечной: главный уровень
• Описание подвала: полностью отделанный, частично отделанный, отапливаемый, внутренний доступ, кладовая
• Имеется чердак
• Чердак Описание: прогулочный коридор, складское помещение

• Семейный номер
• Характеристики: камин, деревянный пол
• Уровень: Главный

• Столовая
• Характеристики: Деревянный пол, Стена / ковровое покрытие
• Уровень: Главный

• Кухня
• Характеристики : Барная стойка для завтрака, Обеденная зона, Гранитные стойки, Деревянный пол, Остров, Слайдеры
• Уровень: Основной

• Кухня с едой
• Характеристики: Обеденная зона, Деревянный пол, Прачечная, Кладовая, Слайдеры
• Уровень: Основной

• Офис
• Характеристики: Настенный ковер
• Уровень: Главный

• Спальня
• Характеристики: Настенный / настенный ковер
• Уровень: Верхний

• Главная спальня
• Дерево Характеристики: Полная ванна Этаж, Гардеробная
• Уровень: Верхний

• Спальня
• Характеристики: Деревянный пол
• Уровень: Верхний

• Спальня
• Характеристики: Деревянный пол
• Уровень: Верхний

Характеристики: деревянный пол
• Уровень: верхний
• Комната отдыха / игр
• Характеристики: камин, французские двери, ламинат
9013 5 уровень: нижний
• Гараж под домом, асфальтированный
• Кол-во гаражей: 2
• Палуба, сад, желоба, навес, каменная стена
• Цвет: натуральный
• Внешний сайдинг: вагонка, дерево
• Информация о крыше: Асфальтная черепица
• Тип фундамента: Бетон
• Описание конструкции: Каркас
• Тип новой конструкции: Нет
• Расчищено, угловой участок, прокатка, деревья, забор – камень
• Тип проезжей части: частный
• Особенности для инвалидов: поручни для ванны, безбарьерная душевая
• кв.Ft. Стандартное восточное время. Отапливаемые ниже отметки: 484
• кв. Ft. Стандартное восточное время. Обогреваемый Класс: 3,308
• Год постройки Источник: Public Records
• Начальная школа: Фаун Холлоу
• Средняя школа младшего младшего: Жокей Холлоу
• Средняя школа: Масук
• Система охлаждения: Центральное воздушное охлаждение, Зонирование
• Энергетические характеристики: Окна из термопана
• Топливный бак Расположение: в подвале
• Тип топлива для нагрева: масло
• Тип тепла: плинтус, горячая вода, зонирование
• Описание горячей воды: масло
• Канализация: септик
• Источник воды: Частная система водоснабжения
• Оценочная стоимость: 339 600 долларов США
• Специальная оценка ассоциации: №
• Налог на имущество: 12 049 долларов США
• Налоговый год: июль 2020 г. – июнь 2021 г.
• Направление: Rt 111, (Монро Тпке) к северу, мимо ратуши Монро-Грин и налево на Уилер до угла Хаммертауна и кольцевой дороги Джози… EKB находится на нижнем уровне входа в прихожую. ..
• Зона затопления: №
• Удобства поблизости: оздоровительный клуб, библиотека, парк, детская площадка / площадка, общественный бассейн, общественные места отдыха, конюшни / верховая езда, теннисные корты
• Время внесения изменений в приложение: 2021-01- 21T10: 44: 05.317
• Количество дополнений: 4

Информация о собственности, предоставленная Smart MLS при последнем включении в список в 2021 году. Эти данные могут не совпадать с общедоступными записями. Учить больше.

% PDF-1.4 % 3388 0 объект > эндобдж xref 3388 267 0000000016 00000 н. 0000005696 00000 п. 0000005885 00000 н. 0000005951 00000 п. 0000015759 00000 п. 0000015974 00000 п. 0000016062 00000 п. 0000016166 00000 п. 0000016304 00000 п. 0000016481 00000 п. 0000016544 00000 п. 0000016725 00000 п. 0000016884 00000 п. 0000017060 00000 п. 0000017123 00000 п. 0000017245 00000 п. 0000017391 00000 п. 0000017454 00000 п. 0000017543 00000 п. 0000017632 00000 п. 0000017695 00000 п. 0000017800 00000 п. 0000017863 00000 п. 0000017926 00000 п. 0000017989 00000 п. 0000018192 00000 п. 0000018255 00000 п. 0000018377 00000 п. 0000018480 00000 п. 0000018543 00000 п. 0000018606 00000 п. 0000018815 00000 п. 0000018878 00000 п. 0000019000 00000 н. 0000019103 00000 п. 0000019167 00000 п. 0000019230 00000 п. 0000019405 00000 п. 0000019468 00000 п. 0000019590 00000 п. 0000019693 00000 п. 0000019757 00000 п. 0000019820 00000 п. 0000019942 00000 п. 0000020045 00000 п. 0000020108 00000 п. 0000020285 00000 п. 0000020374 00000 п. 0000020463 00000 п. 0000020526 00000 п. 0000020700 00000 п. 0000020795 00000 п. 0000020889 00000 п. 0000020953 00000 п. 0000021063 00000 п. 0000021126 00000 п. 0000021263 00000 п. 0000021327 00000 п. 0000021470 00000 п. 0000021533 00000 п. 0000021652 00000 п. 0000021715 00000 п. 0000021778 00000 п. 0000021841 00000 п. 0000021904 00000 п. 0000022009 00000 п. 0000022072 00000 н. 0000022135 00000 п. 0000022198 00000 п. 0000022261 00000 п. 0000022383 00000 п. 0000022488 00000 п. 0000022552 00000 п. 0000022666 00000 п. 0000022729 00000 п. 0000022845 00000 п. 0000022909 00000 п. 0000023040 00000 п. 0000023104 00000 п. 0000023230 00000 н. 0000023293 00000 п. 0000023405 00000 п. 0000023468 00000 н. 0000023590 00000 п. 0000023653 00000 п. 0000023781 00000 п. 0000023844 00000 п. 0000023966 00000 п. 0000024029 00000 п. 0000024152 00000 п. 0000024216 00000 п. 0000024371 00000 п. 0000024435 00000 п. 0000024498 00000 п. 0000024562 00000 п. 0000024676 00000 п. 0000024779 00000 п. 0000024951 00000 п. 0000025014 00000 п. 0000025121 00000 п. 0000025213 00000 п. 0000025380 00000 п. 0000025444 00000 п. 0000025557 00000 п. 0000025675 00000 п. 0000025839 00000 п. 0000025902 00000 п. 0000026058 00000 п. 0000026164 00000 п. 0000026349 00000 п. 0000026413 00000 п. 0000026552 00000 п. 0000026648 00000 н. 0000026820 00000 н. 0000026884 00000 п. 0000026989 00000 п. 0000027127 00000 п. 0000027304 00000 п. 0000027368 00000 н. 0000027484 00000 н. 0000027600 00000 п. 0000027781 00000 п. 0000027845 00000 п. 0000027976 00000 п. 0000028079 00000 п. 0000028252 00000 п. 0000028314 00000 п. 0000028427 00000 п. 0000028532 00000 п. 0000028704 00000 п. 0000028767 00000 п. 0000028880 00000 п. 0000028996 00000 н. 0000029202 00000 н. 0000029265 00000 п. 0000029448 00000 н. 0000029549 00000 п. 0000029737 00000 п. 0000029799 00000 н. 0000029958 00000 н. 0000030020 00000 п. 0000030116 00000 п. 0000030225 00000 п. 0000030374 00000 п. 0000030436 00000 п. 0000030600 00000 п. 0000030663 00000 п. 0000030726 00000 п. 0000030815 00000 п. 0000030904 00000 п. 0000031014 00000 п. 0000031077 00000 п. 0000031140 00000 п. 0000031203 00000 п. 0000031265 00000 п. 0000031387 00000 п. 0000031448 00000 п. 0000031557 00000 п. 0000031685 00000 п. 0000031747 00000 п. 0000031808 00000 п. 0000031939 00000 п. 0000032000 00000 н. 0000032131 00000 п. 0000032193 00000 п. 0000032329 00000 н. 0000032391 00000 п. 0000032452 00000 п. 0000032592 00000 п. 0000032654 00000 п. 0000032787 00000 п. 0000032849 00000 п. 0000032961 00000 п. 0000033023 00000 п. 0000033138 00000 п. 0000033201 00000 п. 0000033264 00000 н. 0000033383 00000 п. 0000033445 00000 п. 0000033576 00000 п. 0000033638 00000 п. 0000033700 00000 п. 0000033789 00000 п. 0000033878 00000 п. 0000033941 00000 п. 0000034003 00000 п. 0000034126 00000 п. 0000034189 00000 п. 0000034328 00000 п. 0000034391 00000 п. 0000034514 00000 п. 0000034577 00000 п. 0000034640 00000 п. 0000034703 00000 п. 0000034765 00000 п. 0000034885 00000 п. 0000034947 00000 п. 0000035085 00000 п. 0000035147 00000 п. 0000035209 00000 п. 0000035333 00000 п. 0000035396 00000 п. 0000035520 00000 п. 0000035584 00000 п. 0000035647 00000 п. 0000035709 00000 п. 0000035823 00000 п. 0000035886 00000 п. 0000035949 00000 п. 0000036112 00000 п. 0000036201 00000 п. 0000036290 00000 н. 0000036353 00000 п. 0000036416 00000 п. 0000036521 00000 п. 0000036585 00000 п. 0000036649 00000 п. 0000036712 00000 п. 0000036835 00000 п. 0000036898 00000 п. 0000036962 00000 п. 0000037094 00000 п. 0000037158 00000 п. 0000037222 00000 п. 0000037333 00000 п. 0000037396 00000 п. 0000037516 00000 п. 0000037579 00000 п. 0000037642 00000 п. 0000037705 00000 п. 0000037794 00000 п. 0000037883 00000 п. 0000037946 00000 п. 0000038009 00000 п. 0000038129 00000 п. 0000038192 00000 п. 0000038256 00000 п. 0000038320 00000 п. 0000038409 00000 п. 0000038498 00000 п. 0000038562 00000 п. 0000038626 00000 п. 0000038689 00000 п. 0000038817 00000 п. 0000038880 00000 п. 0000038943 00000 п. 0000039007 00000 п. 0000039117 00000 п. 0000039181 00000 п. 0000039245 00000 п. 0000039364 00000 н. 0000039427 00000 н. 0000039560 00000 п. 0000039623 00000 п. 0000039763 00000 п. Vj14h̫% zdzhOk && v: f

Amutah C, Greenidge K, Mante A, Munyikwa M, Surya SL, Higginbotham E, Jones
Д.С., Лавиццо-Мурей Р., Робертс Д., Цай Дж., Эйсола Дж.Искажение расы –
Роль медицинских школ в распространении предвзятости врачей. N Engl J Med. 2021 6 января
DOI: 10.1056 / NEJMms2025768. Epub впереди печати. PMID: 33406326.

Aysola J, Xu C, Huo H, Werner RM. Отношения между пациентом
Опыт, качество и использование услуг первичной медико-санитарной помощи. J Patient Exp.
2020 декабрь; 7 (6): 1678-1684. DOI: 10.1177 / 2374373520924190. Epub 2020 26 мая. PMID:
33457630; PMCID: PMC7786755.

Алексис Д.А., Кирни, доктор медицины, Уильямс Дж. К., Сюй К., Хиггинботэм Е. Д., Эйсола Дж.
Оценка восприятия профессионализма среди преподавателей, слушателей, сотрудников и
Студенты в крупной университетской системе здравоохранения. JAMA Netw Open. 2020 ноябрь
2; 3 (11): e2021452. DOI: 10.1001 / jamanetworkopen.2020.21452. PMID: 33226428;
PMCID: PMC7684446.

Gordon EKB, Clapp JT, Heins SJ, Gaulton TG, Lane-Fall MB, Aysola J, Баранов
Д.Ю., Флейшер Л.А.Роль собеседования при выборе места жительства: смешанный –
методы исследования. Med Educ. 2020 ноя; 54 (11): 1029-1039. DOI: 10.1111 / medu.14248.
Epub 2020 3 августа. PMID: 32434271.

Мамтани М., Шофер Ф, Мудан А., Хатри Ю., Уокер Р., Перроне Дж., Айсола Дж.
Количественная оценка гендерного неравенства в авторстве врачей среди статей-комментариев
в трех влиятельных медицинских журналах: обсервационное исследование. BMJ Open. 2020 год
25 февраля; 10 (2): e034056.DOI: 10.1136 / bmjopen-2019-034056. PMID: 32102817; PMCID:
PMC7044872.

Upton E, Sangal RB, Blutinger E, Khachatryan M, Aysola J, Mamtani M. Женский
Перспективы пациентов из поколения миллениума в отделении неотложной помощи: качественный
анализ. Am J Emerg Med. 2020 ноя; 38 (11): 2462-2464. DOI:
10.1016 / j.ajem.2020.02.026. Epub 2020 21 февраля. PMID: 32224040.

Folberg R, Higginbotham EJ. Введение в опытных офтальмологов
COVID-19 От редакции.Am J Ophthalmol. 2020 декабрь; 220: A1. DOI:
10.1016 / j.ajo.2020.07.017. Epub 2020, 19 сентября. PMID: 32961117; PMCID: PMC7501829.

Пэрриш РК 2-й, Хиггинботам EJ. Что означает телемедицина для лечения
Пациенты с глаукомой в возрасте COVID-19? Am J Ophthalmol. 2020 год
Октябрь; 218: A1-A2. DOI: 10.1016 / j.ajo.2020.07.038. Epub 2020 13 августа. PMID: 32800310;
PMCID: PMC7423579.

Higginbotham EJ. Трансформационная концепция: толщина центральной роговицы.
Офтальмология. 2020 апр; 127 (4S): S70-S71. DOI: 10.1016 / j.ophtha.2019.11.027.
PMID: 32200828.

Agawu A, Fahl C, Alexis D, Diaz T, Harris D, Harris MC, Aysola J, Cronholm
П.Ф., Хиггинботэм Э.Дж. Влияние пола и недопредставленного меньшинства
Статус в рейтинге программ резидентуры для студентов-медиков. J Natl Med Assoc. 2019 год
Декабрь; 111 (6): 665-673. DOI: 10.1016 / j.jnma.2019.09.002. Epub 2019, 23 октября. PMID:
31668360.

Lett LA, Murdock HM, Orji WU, Aysola J, Sebro R. Расовые / этнические тенденции
Представительство среди студентов-медиков США. JAMA Netw Open. 2019 сентябрь
4; 2 (9): e10. DOI: 10.1001 / jamanetworkopen.2019.10490. PMID: 31483469; PMCID:
PMC6727686.

Adelekun AA, Beltrán S, Carney J, Lett LA, Orji WU, Rider-Longmaid E, Stokes
DC, Teeple S, Aysola J. Признание расизма в медицине: организовано студентами и
Конференция специалистов в области здравоохранения с участием местных сообществ.Справедливость в отношении здоровья. 2019 август
12; 3 (1): 395-402. DOI: 10,1089 / heq.2019.0015. PMID: 31406953; PMCID: PMC6689186.

Zeidan AJ, Khatri UG, Aysola J, Shofer FS, Mamtani M, Scott KR, Conlon LW,
Lopez BL. Неявное предвзятое обучение и обучение неотложной медицине: шаг первый?
Осведомленность. AEM Educ Train. 2018 24 сентября; 3 (1): 81-85. DOI: 10.1002 / aet2.10124.
PMID: 30680351; PMCID: PMC6339553.

Aysola J, Barg FK, Martinez AB, Kearney M, Agesa K, Carmona C, Higginbotham
Э.Восприятие факторов, связанных с инклюзивной работой и обучением
Среда в организациях здравоохранения: качественный нарративный анализ.
JAMA Netw Open. 2018 3 августа; 1 (4): e181003. DOI: 10.1001 / jamanetworkopen.2018.1003.
PMID: 30646094; PMCID: PMC6324264.

Гордон МО, Хиггинботэм Э.Дж., Хойер Д.К., Пэрриш РК 2-й, Робин А.Л., Моррис ПА,
Данн Д.А., Уилсон Б.С., Касс М.А.; Исследование лечения глазной гипертензии. Оценка
Влияние комитета по конечным точкам в исследовании лечения глазной гипертензии.
Am J Ophthalmol. 2019 Март; 199: 193-199. DOI: 10.1016 / j.ajo.2018.11.006. Epub 2018
22 ноября. PMID: 30471242; PMCID: PMC6382552.

Айсола Дж., Харрис Д., Хо Х., Райт К.С., Хиггинботэм Э. Измерение
Организационно-культурная компетенция для поощрения разнообразия в академическом здравоохранении
Организации. Справедливость в отношении здоровья. 2018 8 ноября; 2 (1): 316-320. DOI:
10,1089 / га. 2018,0007. PMID: 30426110; PMCID: PMC6231484.

Хиггинботэм Э.Дж., Алексис Д.Новее обязательно лучше? Эволюция
года Хирургия послеоперационной глаукомы за последние 100 лет. Am J Ophthalmol. 2018
Июль; 191: XXV-XXIX. DOI: 10.1016 / j.ajo.2018.04.009. Epub 2018, 13 апреля. PMID:
29655641.

Aysola J, Schapira MM, Huo H, Werner RM. Организационные процессы и
Опыт пациентов в ориентированном на пациента медицинском доме. Med Care. 2018
Июнь; 56 (6): 497-504. DOI: 10.1097 / MLR.0000000000000910. PMID: 29629923; PMCID:
PMC5945304.

Higginbotham EJ. Развитие поля зрения сложнее, чем соответствует стандарту
Глаз. JAMA Ophthalmol. 2018 1 апреля; 136 (4): 335-336. DOI:
10.1001 / jamaophthalmol.2017.6852. PMID: 29450474.

Айсола Дж., Майерс Дж. С.. Интеграция обучения в повышение качества и здоровье
Справедливость в высшем медицинском образовании: две программы по цене одной. Acad
Med. 2018 Янв; 93 (1): 31-34. DOI: 10.1097 / ACM.0000000000002021. PMID: 244.

Higginbotham EJ. Особое внимание к страховому покрытию не приведет к глазам
Справедливость в отношении здоровья. Офтальмология. 2017 Октябрь; 124 (10): 1437-1439. DOI:
10.1016 / j.ophtha.2017.06.030. PMID: 28938921.

Lane-Fall MB, Miano TA, Aysola J, Augoustides JGT. Разнообразие в странах с формирующимся рынком
Персонал интенсивной терапии: анализ демографических тенденций среди стипендиатов интенсивной терапии
С 2004 по 2014 год. Crit Care Med. 2017 Май; 45 (5): 822-827. DOI:
10.1097 / CCM.0000000000002322. PMID: 28282303; PMCID: PMC5392161.

Хиггинботам Э.Дж., Коулман А.Л., Тойч С. Здоровье глаз необходимо для населения
Приоритет здоровья. Am J Ophthalmol. 2017 Янв; 173: vii-viii. DOI:
10.1016 / j.ajo.2016.10.003. Epub 2016, 23 ноября. PMID: 27889015.

Chaiyachati KH, Grande DT, Aysola J. Социальные системы здравоохранения
детерминанты здоровья: современные обещания, подводные камни и возможности
политики.Am J Manag Care. 1 ноября 2016; 22 (11): e393-e394. PMID: 27849349.

Yehia BR, Calder D, Flesch JD, Hirsh RL, Higginbotham E, Tkacs N, Crawford
Б., Фишман Н. Улучшение здоровья ЛГБТ в академическом медицинском центре: пример из практики.
Здоровье ЛГБТ. 2015 декабрь; 2 (4): 362-6. DOI: 10.1089 / lgbt.2014.0054. Epub 2014 16 декабря
PMID: 26788778.

Higginbotham EJ, Хиггинботам LA. Формирование взглядов пациентов на медицину
Марихуана для лечения глаукомы.JAMA Ophthalmol. 2016 Март; 134 (3): 265-6. DOI:
10.1001 / jamaophthalmol.2015.5290. PMID: 26720489.

Higginbotham EJ. Включение как основная компетенция профессионализма в
Двадцать первый век. Pharos Alpha Omega Alpha Honor Med Soc. 2015
Осень; 78 (4): 6-9. PMID: 26665965.

Savatovsky E, Mwanza JC, Budenz DL, Feuer WJ, Vandenbroucke R, Schiffman JC,
Андерсон Д.Р .; Исследование лечения глазной гипертензии. Продольные изменения в
перипапиллярная атрофия в исследовании лечения глазной гипертензии: случай-контроль
оценка.Офтальмология. 2015 Янв; 122 (1): 79-86. DOI:
10.1016 / j.ophtha.2014.07.033. Epub 2014 7 сентября. PMID: 25208858; PMCID:
PMC4682350.

Higginbotham EJ, Upadhyay A, Egbuonu-Davis L. Новый патентный закон может быть
ускорить внедрение инноваций в офтальмологии. JAMA Ophthalmol. 2014 Февраль; 132 (2): 137-8.
DOI: 10.1001 / jamaophthalmol.2013.5645. PMID: 24310429.

Гардинер СК, Демирель С., Де Мораес К. Г., Либманн Дж. М., Чоффи Г. А., Ритч Р.,
Гордон М.О., Касс М.А.; Группа изучения лечения глазной гипертензии.Длина серии
используется во время анализа тенденций, влияет на чувствительность к изменениям скорости прогрессирования в
исследование лечения глазной гипертензии. Инвестируйте Ophthalmol Vis Sci. 2013 февраль
15; 54 (2): 1252-9. DOI: 10.1167 / iovs.12-10218. PMID: 23349433; PMCID: PMC3597197.

Higginbotham EJ. Интервью с доктором медицины Ив Дж. Хиггинботэм. Джордж Б.
Бартли, доктор медицины. JAMA Ophthalmol. 2013 Янв; 131 (1): 96-7. DOI:
10.1001 / jamaophthalmol.2013.1640. PMID: 23307218.

KoreaMed Synapse

2. Связанная статистика. Корейский национальный онкологический центр. доступ 1 апреля 2011 г. Доступно на http://www.ncc.re.kr.


3. Струмберг Д. Доклиническая и клиническая разработка перорального ингибитора мультикиназы сорафениба в лечении рака. Наркотики сегодня (Barc). 2005. 41: 773–784.


4. Sze KM, Wong KL, Chu GK, Lee JM, Yau TO, Oi-Lin Ng I. Потеря фосфатазы и гомолога тензина усиливает клеточную инвазию и миграцию через активацию фактора транскрипции AKT / Sp-1 / матричной металлопротеиназы 2 в гепатоцеллюлярных клетках. карцинома и имеет клинико-патологическое значение.Гепатология. 2011. 53: 1558–1569.


5. Minguez B, Tovar V, Chiang D, Villanueva A, Llovet JM. Патогенез гепатоцеллюлярной карциномы и молекулярная терапия. Курр Опин Гастроэнтерол. 2009. 25: 186–194.


6. Чапарро М., Гонсалес Морено Л., Траперо-Маруган М., Медина Дж., Морено-Отеро Р. Фармакологическая терапия гепатоцеллюлярной карциномы сорафенибом и другими пероральными препаратами. Алимент Pharmacol Ther. 2008. 28: 1269–1277.


7. Cheng AL, Kang YK, Chen Z, Tsao CJ, Qin S, Kim JS, Luo R, Feng J, Ye S, Yang TS, Xu J, Sun Y, Liang H, Liu J, Wang J, Tak WY , Пан Х., Бурок К., Цзоу Дж., Волиотис Д., Гуань З.Эффективность и безопасность сорафениба у пациентов в Азиатско-Тихоокеанском регионе с запущенной гепатоцеллюлярной карциномой: рандомизированное двойное слепое плацебо-контролируемое исследование фазы III. Ланцет Онкол. 2009. 10: 25–34.


8. Абу-Альфа Г.К., Шварц Л., Риччи С., Амадори Д., Санторо А., Фигер А., Де Греве Дж., Дуйяр Д. Ю., Латиа С., Шварц Б., Тейлор И., Московичи М., Сальц Л. Б. Фаза II исследования сорафениба у пациентов с запущенной гепатоцеллюлярной карциномой. J Clin Oncol. 2006. 24: 4293–4300.


9.Bhide RS, Cai ZW, Zhang YZ, Qian L, Wei D, Barbosa S, Lombardo LJ, Borzilleri RM, Zheng X, Wu LI, Barrish JC, Kim SH, Leavitt K, Mathur A, Leith L, Chao S, Wautlet B , Mortillo S, Jeyaseelan R Sr, Kukral D, Hunt JT, Kamath A, Fura A, Vyas V, Marathe P, D’Arienzo C., Derbin G, Fargnoli J. Открытие и доклинические исследования (R) -1- (4 – (4-фтор-2-метил-1H-индол-5-илокси) -5-метилпирроло [2,1-f] [1,2,4] триазин-6-илокси) пропан-2-ол (BMS- 540215), in vivo активный мощный ингибитор VEGFR-2. J Med Chem. 2006 г.49: 2143–2146.


10. Huynh H, Ngo VC, Fargnoli J, Ayers M, Soo KC, Koong HN, Thng CH, Ong HS, Chung A, Chow P, Pollock P, Byron S, Tran E. Аланинат бриваниба, двойной ингибитор сосудистого рецептор эндотелиального фактора роста и тирозинкиназы рецептора фактора роста фибробластов индуцируют ингибирование роста на мышиных моделях гепатоцеллюлярной карциномы человека. Clin Cancer Res. 2008. 14: 6146–6153.


11. Чжу XD, Чжан Дж.Б., Фан PL, Сюн YQ, Чжуан ПИ, Чжан В., Сюй Х., Гао DM, Конг LQ, Ван Л., Ву В.З., Тан З.Й., Дин Х, Сунь Х.С.Антиангиогенные эффекты пазопаниба на моделях гепатоцеллюлярной карциномы с ксенотрансплантатом: оценка с помощью количественной контрастной ультрасонографии. BMC Рак. 2011. 11:28.


12. Мендельсон Дж. Ориентация на рецептор эпидермального фактора роста для лечения рака. J Clin Oncol. 2002. 20: 1С – 13С.


13. Крис М.Г., Натале Р.Б., Хербст Р.С., Линч Т.Дж.-младший, Прагер Д., Белани С.П., Шиллер Дж. Х., Келли К., Спиридонидис Х., Сандлер А., Альбайн К.С., Селла Д., Вольф М.К., Авербух С.Д., Охс Дж.Дж., Кей AC.Эффективность гефитиниба, ингибитора тирозинкиназы рецептора эпидермального фактора роста, у пациентов с симптомами немелкоклеточного рака легкого: рандомизированное исследование. ДЖАМА. 2003. 290: 2149–2158.


14. Shepherd FA, Rodrigues Pereira J, Ciuleanu T, Tan EH, Hirsh V, Thongprasert S, Campos D, Maoleekoonpiroj S, Smylie M, Martins R, van Kooten M, Dediu M, Findlay B, Tu D, Johnston D, Bezjak A, Clark G, Santabárbara P, Seymour L. Группа клинических испытаний Национального института рака Канады.Эрлотиниб при ранее леченном немелкоклеточном раке легкого. N Engl J Med. 2005. 353: 123–132.


15. Томас М.Б., Чада Р., Гловер К., Ван X, Моррис Дж., Браун Т., Рашид А., Дэнси Дж., Аббруззезе Дж. Л.. Фаза 2 исследования эрлотиниба у пациентов с неоперабельной гепатоцеллюлярной карциномой. Рак. 2007. 110: 1059–1067.


16. Филип П.А., Махони М.Р., Аллмер К., Томас Дж., Пито Х.С., Ким Дж., Донехауэр Р.К., Fitch Т., Пикус Дж., Эрлихман К. Исследование фазы II эрлотиниба (OSI-774) у пациентов с распространенным гепатоцеллюлярным раком.J Clin Oncol. 2005. 23: 6657–6663.


17. Висснер А., Овербек Э., Райх М.Ф., Флойд М.Б., Джонсон Б.Д., Мамуя Н., Росфьорд Э.С., Дискафани К., Дэвис Р., Ши Х, Рабиндран С.К., Грубер Б.К., Йе Ф, Халлетт В.А., Нилакантан Р., Шен Р. , Ван Ю.Ф., Гринбергер Л.М., Цоу HR. Синтез и взаимосвязь структура-активность 6,7-дизамещенных 4-анилинохинолин-3-карбонитрилов. Разработка перорально активного необратимого ингибитора тирозинкиназной активности рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) и рецептора-2 эпидермального фактора роста человека (HER-2).J Med Chem. 2003. 46: 49–63.


18. Ganne-Carrié N, Trinchet JC. Системное лечение гепатоцеллюлярной карциномы. Eur J Gastroenterol Hepatol. 2004. 16: 275–281.


19. Herr I, Schemmer P, Buchler MW. На ПУТИ к терапевтическому вмешательству при заболеваниях печени. Гепатология. 2007. 46: 266–274.


20. Иванчук С.М., Рутка Ю.Т. Клеточный цикл: ускорители, тормоза и контрольные точки. Нейрохирургия. 2004. 54: 692–699.


21. Massagué J. Контроль клеточного цикла G1 и рак.Природа. 2004. 432: 298–306.


22. Энгельман Дж. А., Зейнуллаху К., Мицудоми Т., Сонг Й, Хайленд К., Парк Дж. О., Линдеман Н., Гейл С. М., Чжао Х, Кристенсен Дж., Косака Т., Холмс А. Дж., Роджерс А. М., Каппуццо Ф., Мок Т., Ли К. , Johnson BE, Cantley LC, Jänne PA. Амплификация МЕТ приводит к устойчивости к гефитинибу при раке легких за счет активации передачи сигналов ERBB3. Наука. 2007. 316: 1039–1043.


23. Desbois-Mouthon C, Cacheux W., Blivet-Van Eggelpoël MJ, Barbu V, Fartoux L, Poupon R, Housset C, Rosmorduc O.Влияние перекрестных переговоров IGF-1R / EGFR на чувствительность клеток гепатомы к гефитинибу. Int J Cancer. 2006. 119: 2557–2566.


24. García JM, Silva J, Peña C, Garcia V, Rodríguez R, Cruz MA, Cantos B, Provencio M, España P, Bonilla F. Метилирование промотора гена PTEN является распространенным молекулярным изменением при раке груди. Гены Хромосомы Рак. 2004. 41: 117–124.


25. Ван Х, Тротман Л.С., Коппи Т., Алимонти А., Чен З., Гао З., Ван Дж., Эрдджумент-Бромаж Х, Темпст П., Кордон-Кардо С., Пандольфи П.П., Цзян Х.NEDD4-1 представляет собой протоонкогенную убиквитинлигазу для PTEN. Клетка. 2007. 128: 129–139.


26. Сэмюэлс Й., Ван З., Барделли А., Силлиман Н., Птак Дж., Сабо С., Ян Х., Газдар А., Пауэлл С. М., Риггинс Г. Дж., Уилсон Дж. К., Марковиц С., Кинзлер К. В., Фогельштейн Б., Велкулеску В. Е.. Высокая частота мутаций гена PIK3CA при раке человека. Наука. 2004. 304: 554.


27. Rouleau E, Spyratos F, Dieumegard B, Guinebretière JM, Lidereau R, Bièche I. Статус мутации KRAS при колоректальном раке для прогнозирования ответа на терапию, направленную на EGFR: необходимость более точного определения.Br J Рак. 2008. 99: 2100.


28. Су MC, Льен ХК, Дженг Ю.М. Отсутствие мутации экзона 18-21 рецептора эпидермального фактора роста при гепатоцеллюлярной карциноме. Cancer Lett. 2005. 224: 117–121.


29. Ли С. К., Лим С. Г., Су Р., Се В. С., Го Дж. Й., Путти Т., Тао К., Сунг Р., Го БК. Отсутствие соматических мутаций в домене тирозинкиназы EGFR при гепатоцеллюлярной и носоглоточной карциноме. Pharmacogenet Genomics. 2006. 16: 73–74.


ТЕОРИЯ ПУСТОГО ГОЛОСОВАНИЯ И СКРЫТОГО СОБСТВЕННОСТИ на JSTOR

Абстрактный

ЗА последние двадцать пять лет рынки деривативов выросли в геометрической прогрессии.Крупные современные рынки деривативов все чаще позволяют инвесторам иметь экономические интересы в корпорациях, не имея права голоса, и наоборот. Это приводит как к пустым избирателям – инвесторам, чьи права голоса в корпорации превышают их экономические интересы, так и к скрытым владельцам – инвесторам, чьи экономические интересы превышают их права голоса. Мы представляем формальный анализ, который показывает, как в условиях непрозрачности финансовых рынков пустое голосование и скрытая собственность могут сделать финансовые рынки непредсказуемыми, нестабильными и неэффективными.Напротив, мы показываем, что, когда финансовые рынки прозрачны, пустое голосование и скрытая собственность имеют совершенно разные эффекты: они следуют предсказуемым схемам, способствуют стабильным результатам и способствуют эффективности. Наш анализ позволяет лучше понять работу рынков ценных бумаг в целом и рынков деривативов в частности. Он также дает новое обоснование для надежного режима обязательного раскрытия информации и облегчает анализ предлагаемых основных положений о ценных бумагах.

Информация о журнале

The Virginia Law Review – это общеправовой журнал, публикуемый студентами юридического факультета Университета Вирджинии.Постоянной целью Virginia Law Review является публикация профессионального периодического издания, посвященного правовым и связанным с законом вопросам, которое может быть полезно судьям, практикам, учителям, законодателям, студентам и другим лицам, интересующимся законом. Впервые официально организованный 23 апреля 1913 года, Virginia Law Review сегодня остается одним из самых уважаемых и влиятельных студенческих юридических периодических изданий в стране.

Информация об издателе

The Virginia Law Review публикуется Независимым издательским учреждением Virginia Law Review Association. укомплектован и направлен исключительно студентами-юристами юридического факультета Университета Вирджинии.Обзор закона Вирджинии была постоянно организована 23 апреля 1913 года, и сегодня в ее рядах около восьмидесяти нынешних студентов-членов и сотни выпускников по всей стране. Члены Ассоциации обзора законодательства штата Вирджиния выбирают и редактируют все статьи. опубликовано в восьми ежегодных выпусках журнала Virginia Law Review.

Кинетический анализ васкулогенеза дает информацию о механистических исследованиях

Am J Physiol Cell Physiol. 2017 г. 1 апреля; 312 (4): C446 – C458.

, ^{1, 2} , ^{3, 4} , ⁵ , ⁵ , ^{2, 6} , ^{1, 2} , ^{3, 4} и ^{1, 2, 6, 7, 8}

Каэла М. Варберг

¹ Отделение клеточной и интегративной физиологии Медицинской школы Университета Индианы, Индианаполис, Индиана;

² Герман Б.Центр педиатрических исследований Уэллса, Индианаполис, Индиана;

Сет Винфри

³ Индианский центр биологической микроскопии, Индианаполис, Индиана;

⁴ Медицинский факультет Медицинской школы Университета Индианы, Индианаполис, Индиана;

Chenghao Chu

⁵ Кафедра биостатистики, Школа медицины Университета Индианы, Индианаполис, Индиана;

Wanzhu Tu

⁵ Кафедра биостатистики, Школа медицины Университета Индианы, Индианаполис, Индиана;

Эмили К.Синий

² Центр педиатрических исследований Германа Б. Уэллса, Индианаполис, Индиана;

⁶ Департамент педиатрии, Медицинский факультет Университета Индианы, Индианаполис, Индиана;

Кассандра Р. Гон

¹ Отделение клеточной и интегративной физиологии Медицинской школы Университета Индианы, Индианаполис, Индиана;

² Центр педиатрических исследований Германа Б. Уэллса, Индианаполис, Индиана;

Кеннет В.Данн

³ Индианский центр биологической микроскопии, Индианаполис, Индиана;

⁴ Медицинский факультет Медицинской школы Университета Индианы, Индианаполис, Индиана;

Лаура С. Ханелин

¹ Отделение клеточной и интегративной физиологии Медицинской школы Университета Индианы, Индианаполис, Индиана;

² Центр педиатрических исследований Германа Б. Уэллса, Индианаполис, Индиана;

⁶ Департамент педиатрии, Медицинский факультет Университета Индианы, Индианаполис, Индиана;

⁷ Отделение микробиологии и иммунологии Медицинской школы Университета Индианы, Индианаполис, Индиана; и

⁸ Онкологический центр Саймона Университета Индианы, Медицинский факультет Индианского университета, Индианаполис, Индиана

¹ Отделение клеточной и интегративной физиологии Медицинского факультета Индианского университета, Индианаполис, Индиана;

² Герман Б.Центр педиатрических исследований Уэллса, Индианаполис, Индиана;

³ Индианский центр биологической микроскопии, Индианаполис, Индиана;

⁴ Медицинский факультет Медицинской школы Университета Индианы, Индианаполис, Индиана;

⁵ Кафедра биостатистики, Медицинский факультет Университета Индианы, Индианаполис, Индиана;

⁶ Департамент педиатрии, Медицинский факультет Университета Индианы, Индианаполис, Индиана;

⁷ Отделение микробиологии и иммунологии Медицинской школы Университета Индианы, Индианаполис, Индиана; и

⁸ Центр рака Саймона Университета Индианы, Медицинский факультет Университета Индианы, Индианаполис, Индиана

Автор, отвечающий за переписку.Адрес для запросов на перепечатку и другой корреспонденции: L. S. Haneline, 699 Riley Hospital Dr., RR 207, Indianapolis, IN 46202 (электронная почта: ude.ui@nilenahl).

Поступило 27 декабря 2016 г .; Пересмотрено 12 января 2017 г .; Принято, 2017 г. 13 января.

Авторские права © Американское физиологическое общество, 2017 г. Эта статья цитируется в других статьях в PMC.

Дополнительные материалы

Видео 1

GUID: 69A01A43-1CED-4916-AA11-3CDE197BFA32

Видео 2

GUID: 09480866-AA1B-41BF-9F57-A519AEC6E419

Abstract

Васкулогенез – это сложный процесс, при котором эндотелиальные стволовые клетки и клетки-предшественники претерпевают образование сосудов de novo.Количественная оценка васкулогенеза является центральным показателем функциональности эндотелиальных клеток-предшественников. Однако в современных анализах отсутствуют кинетические измерения. Для решения этой проблемы были разработаны новые подходы к количественной оценке образования сети эндотелиальных колониеобразующих клеток (ECFC) in vitro в режиме реального времени. Восемь параметров сетевой структуры были количественно определены с использованием нового программного обеспечения кинетического анализа васкулогенеза (KAV). KAV-оценка сложности структуры позволила выделить две фазы формирования сети.Это наблюдение привело к разработке дополнительных васкулогенных показателей. Метод тканевой цитометрии был разработан для количественной оценки частоты и локализации делящихся ECFC. Кроме того, Fiji TrackMate использовался для количественной оценки смещения и скорости ECFC на уровне отдельной ячейки во время формирования сети. Эти новые подходы были затем применены для определения того, как внутриутробное воздействие материнского сахарного диабета (СД) ухудшает васкулогенез ECFC плода. ECFC плода, подвергшиеся воздействию материнского DM, образуют меньшее количество начальных сетевых структур, которые не стабильны во времени.Корреляционный анализ показал, что выборки ECFC с большим разделением по ветвям образуют меньше закрытых сетевых структур. Кроме того, уменьшение среднего движения ECFC с течением времени снижает структурную связанность. Идентификация этих новых фенотипов с использованием недавно установленных методологий предоставляет доказательства клеточных механизмов, вносящих вклад в аберрантный васкулогенез ECFC.

Ключевые слова: эндотелиальный, васкулогенез, миграция, диабет, пролиферация

васкулогенез является то процесс, с помощью которого эндотелиальные клетки-предшественники (EPC) претерпевают формирование сосудов de novo для создания сосудистой сети эмбриона.Некоторые клетки-предшественники также способны к «постнатальному васкулогенезу», важному механизму сосудистого гомеостаза и образования новых сосудов в ответ на заболевание (6, 7, 20, 28). Продолжаются все более активные исследования для понимания функции EPC во время развития сосудов, а также их потенциального терапевтического использования для послеродового восстановления сосудов (5, 22, 29, 39, 41).

Asahara et al. обнаружили, что циркулирующие EPC включаются в активные центры ангиогенеза, и предложили инфузию EPC в качестве ангиогенной терапии (6).Термин «эндотелиальная клетка-предшественник» описывает различные типы клеток, определяемые образованием колоний или маркерами клеточной поверхности (8, 25, 30, 32, 33). Эндотелиальные колониеобразующие клетки (ECFC) представляют собой четко определенную популяцию клеток, которая демонстрирует ключевые характеристики незрелого EPC, включая высокий пролиферативный потенциал, способность к самообновлению и образование сосудов de novo in vivo (24, 25, 46). Более того, ECFC находятся в эндотелии для поддержания целостности сосудов и циркулируют в крови для облегчения образования или восстановления сосудов (24, 45).Хотя немногие исследования оценивают ECFC как клеточную терапию для регенерации тканей, их потенциальные применения многочисленны из-за их уникальных пролиферативных и васкулогенных свойств (18, 32). Кроме того, ECFC обогащены пуповинной кровью и могут дать представление о влиянии аномальной внутриматочной среды на повышенный риск развития у детей сосудистых заболеваний, таких как гипертония и сердечно-сосудистые заболевания (11, 23, 26). Следовательно, ECFC представляют собой уникальную васкулогенную популяцию с терапевтическим потенциалом, которая может оказаться полезной для прогнозирования долгосрочного воздействия аномального воздействия внутриутробной среды.

Лица, подвергшиеся как гестационному, так и прегестационному диабету в утробе матери, подвергаются повышенному риску развития хронических заболеваний, таких как высокое кровяное давление, в более позднем возрасте (10, 13, 21). Воздействие диабетической внутриматочной среды отрицательно сказывается на количестве и функции эндотелиальных клеток-предшественников (7, 9). ECFCs, подверженные материнскому диабету в утробе матери, претерпевают преждевременное старение и обладают пониженным пролиферативным потенциалом, пониженной клоногенной способностью и нарушением васкулогенеза (23).Таким образом, контакт новорожденных с ECFC в диабетической внутриматочной среде приводит к значительным функциональным нарушениям, механизмы которых неизвестны. Следовательно, необходим углубленный анализ васкулогенеза ECFC, чтобы определить, как и почему функциональные нарушения возникают в утробе матери.

Моделирование васкулогенеза путем посева клеток во внеклеточный матрикс – это стандартное количественное измерение для оценки функции in vitro (4, 27, 31), позволяющее быстро анализировать клетки для выполнения основных задач формирования сети или сосудов (15, 17, 38) .Однако стандартные методы ограничены по объему и не могут охватить многие аспекты этого очень динамичного процесса. Хотя были предприняты попытки расширить количественный анализ, существующих методов недостаточно для динамических исследований (27, 36, 40). В этом исследовании были разработаны новые методы количественной кинетической оценки васкулогенеза in vitro. С использованием трех методов визуализации были разработаны многочисленные количественные измерения васкулогенеза. Эти новые методы позволяют глубоко изучить васкулогенный процесс для выявления функциональных различий между ECFC при неосложненных беременностях и беременностях, осложненных сахарным диабетом 2 типа.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Сбор образцов пуповинной крови.

Образцы пуповинной крови были собраны во время родов после письменного информированного согласия матерей. Образцы были взяты у женщин с неосложненной беременностью (ЯК) и у женщин, у которых до беременности был диагностирован сахарный диабет 2 типа (СД2). Все беременности протекали при одноплодной беременности. Младенцы с известными хромосомными аномалиями были исключены. Женщины с преэклампсией или гипертонией, женщины с другими заболеваниями, которые, как известно, влияют на метаболизм глюкозы, и женщины, принимающие лекарства, которые, как известно, влияют на метаболизм глюкозы, были исключены.Совет по институциональному обзору Медицинской школы Университета Индианы одобрил этот протокол. Клинические данные по женщинам и младенцам суммированы соответственно в и. Не было выявлено значительных различий между группами ЯК и СД2 по следующим клиническим значениям: возраст матери, индекс массы тела перед беременностью, гестационный возраст, вес младенца, процентиль веса младенца, процентиль веса / длины младенца и весовой индекс (все значения P ). > 0,05).

Таблица 1.

Клинические данные для субъектов матери

Образец	Возраст матери, лет	Лекарство	Беременность матери ИМТ	Hb A1C

0 9

Hb A1C

0 9
10 None 9284 90070 9284 9007 908 33.50 0

Нет	37.2	ND
Несложный 2	32	Отсутствует	27,4	ND
Несложный 3	4	27	Нет	27,6	Нет данных
Несложно 5	25	Нет	22,0	Нет данных		ND
Несложный 7	27	Отсутствует	42,6	ND
Несложный 8	27	Несложный 9	25	Нет	23,8	Нет
Несложный 10	42	Нет	34.6	5,6
T2DM 1	31	Инсулин	25,6	6,8, 6,5
T2DM 2	25		25			, 13,5
T2DM 3	26	Инсулин	30,5	15,2, 12,4, 11,7, 12, 11,9, 14,4
T2DM 4	3811	3811	38118	6,8, 5,8, 6,0
T2DM 5	35	Глибурид	32,9	6,5, 6,0, 5,5
T2DM 6	8118	9,2, 6,7, 5,9
T2DM 7	30	Метформин, глибурид	29,1	5,5, 5,3
T2DM 8			инсулин	4	6,1, 5,7
T2DM 9	31	Инсулин	25,6	6,7, 5,8
T2DM 10	38	38

Таблица 2.

Клинические данные для детей грудного возраста

%

Образец	Пол	Гестационный возраст	Вес ребенка, кг	Процентиль веса ребенка,%	Вес ребенка / длина	Весовой индекс, кг / м 3
Несложный 1	Женский	39	3.7	84,6	55,2	27,2
Неосложненная 2	Женщина	37	3,6	79,4	5,8	3,6	79,4	5,8		23,6 1 0404 908 9086 3,6 70,2 31,9 25,7 Несложный 4 Женский 40 2,9 24.2 1,8 22,3 Неосложненный 5 Мужской 38 3,4 58,3 38,6 26,0 без осложнений 68,1 26,2 25,3 Несложный 7 Женский 39 4,3 98,6 74.4 28,9 Неосложненный 8 Женский 41 3,3 55,2 78,2 28,8 3,3911 3 94 11 11 11 80008 83,1 26,8 Несложный 10 Женский 38 2,9 23,3 1,0 21.9 T2DM 1 Мужской 37 4,5 98,6 91,6 30,4 3,4 T2DM 2 76 9114 28,7 T2DM 3 Мужской 38 3,7 81,1 7,1 23,9 T2DM 4 18 80,0 80,8 29,0 T2DM 5 Внутренняя часть 38 3,2 50,0 13,6 24,3 13,6 24,3 0 9DM 3,3 45,2 88,5 29,7 T2DM 7 Мужской 39 3,9 84,6 34,5 26.0 T2DM 8 Женский 37 2,7 11,9 37,1 26,2 T2DM 9 T2DM 9 3,1 3,1 14 31,1 T2DM 10 Женский 39 3,7 84,6 41,7 26,5 Культура клеток ECFC. ECFC были выделены из образцов пуповинной крови, как описано ранее (9, 23). Пуповинную кровь разбавляли 1: 1 фосфатно-солевым буфером (PBS) и покрывали Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Кровь центрифугировали 30 мин при 740 g . Мононуклеарные клетки выделяли из лейкоцитарной пленки и промывали эндотелиальной ростовой средой 2 (EGM2; Lonza, Walkersville, MD), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, определяемой гиклоном (FBS; ThermoFisher, Waltham, MA), раствором антибиотик-антимикотика (Corning, Manassas , VA) и антибиотик MycoZap PR (Lonza) (EGM2 + 10% FBS).Мононуклеарные клетки ресуспендировали в EGM2 + 10% FBS и помещали в шестилуночные планшеты для культуры ткани, предварительно покрытые коллагеном 1 типа (Corning). После 24 часов культивирования все лунки промывали EGM2 + 10% FBS для удаления неприлипающих клеток, и среду меняли ежедневно в течение 7 дней, а затем через день до первого пассажа. Колонии ECFC появлялись между 5 и 8 днями культивирования. После достижения слияния клетки отделяли 0,25% трипсином-ЭДТА (Invitrogen, Grand Island, NY) и замораживали в 5% диметилсульфоксиде (ThermoFisher) в FBS (Atlanta Biologicals, Flowery Branch, GA).Аликвоты ECFC размораживали, ресуспендировали в EGM2 + 10% FBS и высевали на колбы, покрытые коллагеном типа 1, для культивирования. ECFC, использованные в этих исследованиях, были пассированы от двух до пяти раз. Настройки и оборудование для микроскопии. Все изображения выполнялись на полностью автоматизированном микроскопе Nikon TiE, оснащенном моторизованным предметным столиком ProScan II (Prior Scientific, Rockland, MA), источником ксеноновой лампы, Lambda LS и контроллером колеса фильтра Lambda 10-3 (Sutter Instrument, Novato, США). CA), оснащенный ORCA-ER или ORCA-Flash 4.0 (Хамамацу, Япония) под управлением Elements 4.20 (Nikon Instruments, Мелвилл, Нью-Йорк). Флуоресцентные фильтры были от Quad Sedat v89000 (Chroma Technology, Bellows Falls, VT). В экспериментах с фазово-контрастной визуализацией использовался бесхромовый объектив Infinity (CFI) Plan Fluor dark low low (DLL) × 10, а в экспериментах с флуоресцентной визуализацией для контраста использовался CFI S Plan Fluor для сверхдлинного рабочего расстояния аподизированная темная среда (ELWD ADM). ) × 20 объектив (Nikon Instruments). Множественные изображения и Z-позиции были собраны для покрытия лунок с образцами и сшиты вместе с элементами по мере необходимости.Для получения изображений в реальном времени микроскоп был оснащен инкубатором с верхним столиком с влажностью (75–85%), температурой (37 ° C) и регулированием CO 2 (5%; OkoLab, Burlingame, CA). Анализ матригеля. ECFC ( пассажи 3–4 ) высевали по 400 000 клеток на 100-миллиметровую чашку и инкубировали в течение ночи. На следующий день ECFC обрабатывали трипсином (ThermoFisher), считали на гемоцитометре и высевали при равных плотностях в EGM2 с добавлением 10% FBS. ECFC высевали на 10 мкл матригеля, партия №.4209014 (Corning) на 15-луночных μ-слайдах (Ibidi, США). Предметное стекло Matrigel помещали в верхний инкубатор предметного столика микроскопа для поддержания температуры, CO 2 и влажности, для визуализации живых клеток в течение ночи. Изображения полных лунок собирали с помощью ORCA-ER каждые 15 мин в течение 15 ч, всего 60 точек данных на образец ECFC в каждом эксперименте. Кинетический анализ васкулогенеза. Фазово-контрастные изображения были скомпилированы, обработаны и проанализированы с использованием специального плагина Fiji is Just ImageJ (Fiji) под названием «Кинетический анализ васкулогенеза» (KAV).KAV полагается на плагины Skeletonize 2D / 3D и Analyze Skeleton на Фиджи (3). Программное обеспечение позволяло количественно определять восемь различных параметров васкулогенеза с течением времени, включая закрытые сети, сетевую область, узлы, ветви, соотношение ветвей к узлам, длину ветвей, узлы с тремя расширениями ветвей и узлы с четырьмя расширениями ветвей. В KAV замкнутая сеть была определена как замкнутая территория, окруженная со всех сторон ячейками. Сетевая область – это размер закрытых сетевых отверстий.Определения для узлов и ветвей были созданы, чтобы различать структуры в KAV. Узлы были определены как точки в сети, которые имеют от трех до четырех отделений. Узлы с более чем четырьмя расширениями ветвей не наблюдались. Структура, соединенная по крайней мере на одном конце узлом, была определена как ветвь. Однако ответвления могут быть соединены с обоих концов, как показано на рисунке. KAV рассчитал отношение ветвей к узлам, разделив общее количество ветвей на общее количество узлов, обнаруженных в скважине.Значения, полученные в результате анализа программного обеспечения, были нанесены на график в Prism (GraphPad, Сан-Диего, Калифорния) и R (версия 3.1.1; 34). Кинетический анализ васкулогенеза (KAV) позволяет количественно оценить сетевые показатели. A : изображения формирования сети ECFC получали каждые 15 мин в течение 15 ч с помощью фазово-контрастной микроскопии. Показаны характерные фазово-контрастные изображения с шагом 5 ч, начиная с момента нанесения покрытия ( t = 0). Фазово-контрастные изображения были проанализированы с помощью KAV для создания как «скелета», так и «маски» визуализации сетевой структуры.Масштабная линейка представляет 500 мкм. B : показаны средние данные четырех параметров сетевой структуры. Данные были рассчитаны количественно с использованием недавно разработанного плагина KAV Fiji за 15-часовой период. Верхняя строка представляет собой увеличенную область маски и отображает серым цветом параметр, анализируемый на линейных графиках ниже. Показаны линейные графики для следующих параметров: замкнутые сети, сетевая область, узлы, ветви, общая длина ветви, узлы с тройными ветвями, узлы с четырьмя ветвями и отношение ветвей к узлам.На линейных графиках представлено среднее значение ± стандартная ошибка для 10 отдельных выборок пациенток с неосложненной беременностью. C : для определения ежедневных вариаций схемы анализа, KAV-анализ был проведен для одного образца ECFC в 3 разных дня. Показанные данные представляют собой средние значения ± стандартное отклонение. Коэффициент вариации (%) показан для данных в C . D : для проверки программного обеспечения KAV ручная оценка формирования сети сравнивалась с данными, полученными с помощью KAV для двух отдельных образцов ECFC в 4 разных экспериментальных дня.Количество обнаруженных ветвей было значительно увеличено при использовании KAV по сравнению с ручным подсчетом для обоих образцов (* P <0,05). Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. Иммунофлуоресцентный метод Матригеля. Анализы матригеля были проведены и проанализированы в моменты времени, указанные с использованием иммунофлуоресцентного окрашивания (19). Вкратце, образцы фиксировали 4% параформальдегидом через 5 часов после нанесения покрытия, повышали проницаемость 0,5% Triton X-100 в PBS, гасили 100 мМ глицином и блокировали 0.1% бычий сывороточный альбумин, 0,2% Triton X-100, 0,05% Tween-20 и 10% козья сыворотка (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) в PBS. Образцы инкубировали с первичным антителом к ​​альфа-тубулину в разведении 1: 1000 (№ T6199, клон DM1A; Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) в течение ночи при комнатной температуре. На следующий день козье вторичное антитело против мыши, конъюгированное с Alexa568 (№ A11031; ThermoFisher Scientific), добавляли при 1: 400 в течение 40 минут при комнатной температуре. Образцы визуализировали в PBS, содержащем реагент NucBlue Fixed Cell Stain Ready Probes (№{“type”: “entrez-нуклеотид”, “attrs”: {“text”: “R37605”, “term_id”: “795061”, “term_text”: “R37605”}} R37605; ThermoFisher Scientific) с использованием рекомендованного разбавления на инвертированном микроскопе Nikon TiE с источником ксеноновой лампы и флуоресцентными фильтрами (Chroma Technology). Отрицательные контроли без первичных антител не показали неспецифического вторичного окрашивания антител. Клон антитела против α-тубулина DM1A был выбран из-за его специфичности. Путем вестерн-блоттинга антитело обнаруживает одну полосу при 50 кДа в ECFC (данные не показаны).Кроме того, иммунофлуоресцентное окрашивание на α-тубулин с помощью DM1A дает идентичное окрашивание отдельного клона, который связывает другой эпитоп на α-тубулине (1). Чтобы обеспечить полный охват образцов, было собрано шесть Z-положений. Для изображений с высоким разрешением клетки получали с помощью объектива × 20 на микроскопе Leica SP8 MP. Тканевая цитометрия для идентификации митотических клеток. Иммунофлуоресцентные изображения обрабатывали и анализировали с использованием программного обеспечения для тканевой цитометрии (TC), Volumetric Tissue Exploration and Analysis (VTEA; 43).Программное обеспечение позволяет проводить количественную оценку интенсивности как ядерной, так и цитоплазматической флуоресценции в трех измерениях. Пространственное измерение для оценки локализации ячеек в сетевых структурах (то есть ветвях и узлах) выполняется с использованием комбинации исходного объема изображения и диаграммы рассеяния сигналов, связанных с ячейками. Популяции клеток на диаграмме рассеяния были опрошены с помощью инструмента «стробирования», подобного проточной цитометрии, что позволяет проводить количественный анализ. Клетки идентифицировали по их ядрам после окрашивания ядер реагентом NucBlue Fixed Cell Stain Ready Probes (№{“type”: “entrez-нуклеотид”, “attrs”: {“text”: “R37605”, “term_id”: “795061”, “term_text”: “R37605”}} R37605; ThermoFisher Scientific). Интенсивность окрашивания NucBlue использовали для оценки митотических клеток. В некоторых случаях для подтверждения точности этого подхода использовалось хорошо охарактеризованное антитело против фосфогистона h4 [окрашивание фосфогистоном h4 (Ser10), конъюгированное с Alexa488 в разведении 1:50 (№ 9708; Cell Signaling Technology; 16). )]. Точность интенсивности NucBlue как индикатора митотического противостояния.немитотические клетки и пороги интенсивности для каждого эксперимента оценивались вручную на подобласти одного объема из каждого набора данных. Между всеми экспериментами специфичность, прецизионность и точность составили 96,8 ± 1,3, 56 ± 5,2 и 96,5 ± 1,2%, соответственно (среднее ± стандартное отклонение). Толщина ветвей и узлов определялась с помощью инструмента Local Thickness на Фиджи, который генерировал карту расстояний и, следовательно, толщину маски, полученную в результате окрашивания микротрубочек сети. Эта карта расстояний была добавлена ​​как канал для облегчения анализа изображений с помощью VTEA. Проточно-цитометрический анализ пролиферации. Базовую пролиферацию ECFC оценивали с помощью проточной цитометрии на клетках в стандартных условиях культивирования. Клетки промывали 2% FBS в PBS, ресуспендировали в буфере цитофикса / цитоперма (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния) и инкубировали в течение 20 мин на льду. Суспензии клеток дважды промывали перманентным / промывным буфером (BD Biosciences) с последующей инкубацией с фосфогистоном h4 (Ser10), конъюгированным с Alexa488 (№ 9708; Cell Signaling Technology), в течение 45 минут в темноте при 37 ° C.Суспензии снова промывали перманентным / промывочным буфером и ресуспендировали в 2% FBS в PBS для проточного цитометрического анализа. Образцы анализировали с использованием проточного цитометра LSRII (Becton Dickinson, Сан-Хосе, Калифорния), собирая по меньшей мере 10 000 событий на образец. В анализе использовалось программное обеспечение FlowJo (TreeStar, Ashland, OR). Бакуловирусная система экспрессии ядерного зеленого флуоресцентного белка. ECFC ( пассажи 3–4 ) разделяли и инкубировали в стандартных условиях культивирования в течение ночи.На следующий день добавляли флуоресцентный белок с зеленым ядром CellLight (Nucleus-GFP) BacMam2.0 (ThermoFisher Scientific) при множественности инфицирования 30. Клетки инкубировали в течение ночи и затем обрабатывали для анализов Matrigel, как описано. Анализ подвижности TrackMate. Изображения обрабатывались в Elements (Nikon Instruments) и Fiji (35). Fiji TrackMate использовался для анализа параметров подвижности клеток, включая смещение и скорость. В TrackMate использовался детектор разности Gaussian (DoG) с предполагаемым диаметром пятна 25.0 пикселей и порог 2,0 для обнаружения ядер отдельных клеток. Для отслеживания ячеек на изображениях временного графика использовался трекер простой задачи линейного назначения (LAP) с максимальным расстоянием связывания 50 мкм, максимальным расстоянием закрытия промежутка 90 мкм и максимальным промежутком кадра закрытия промежутка 4. Затем данные анализа TrackMate были проанализированы с помощью R (34). Статистический анализ. Графики формирования кинетической сети для данных KAV были созданы в Prism 6. Графики представляют собой средние значения ± SE в каждый момент времени для размеров выборки, указанных в подписях к рисункам.Для статистического анализа различий между полными кинетическими кривыми данные по отдельным временным точкам были интегрированы для получения кривых расчетных средних разностей и соответствующих 95% доверительных интервалов. Эти кривые были построены с использованием метода сглаживания сплайнов, а анализ был выполнен с использованием пакета Computing Vehicle (MGCV) для смешанной обобщенной аддитивной модели (GAM) в R (34, 44). Для построения гистограммы для анализа подвижности ECFC частота распределения фенотипов была построена таким образом, чтобы диапазоны осей x и y оставались постоянными для каждой переменной между фазами 1 и 2 .Данные были сгруппированы на основе фиксированных значений, при этом размеры ячеек оставались согласованными на разных этапах. Размеры бункера были следующие: смещение – 15; средняя скорость 0,005; и максимальная скорость 0,0015. Корреляции смещения, средней скорости и максимальной скорости были рассчитаны с использованием данных подвижности фазы 1 и фазы 2 как для образцов UC, так и для T2DM. Коэффициент корреляции продукта-момента Пирсона и 95% доверительный интервал были рассчитаны в R. Для моделей коррекции кинетических данных и данных о подвижности была построена многоуровневая модель для проверки линейных соотношений между переменными KAV и подвижностью.Модели включали данные о подвижности фазы 1 и из всех 20 образцов ECFC (10 UC и 10 T2DM). Логарифмические преобразования были применены ко всем трем переменным подвижности для нормализации распределений. Из-за размера выборки для анализа кинетических ассоциаций данных использовались простые модели линейной регрессии. P Значения <0,05 считались значимыми. РЕЗУЛЬТАТЫ Динамическая оценка васкулогенеза ECFC у новорожденных. Текущие методы количественной оценки формирования сети в основном статичны, что дает ограниченное понимание потенциальных механизмов, которые способствуют функциональному дефициту.Чтобы обеспечить реалистичное изображение динамического процесса формирования сети ECFC, продольные данные были проанализированы из фазово-контрастных изображений в течение 15 часов. Для получения количественных данных был создан модуль анализа для пакета обработки изображений Фиджи (35), который будет называться кинетическим анализом васкулогенеза (KAV). KAV использует сегментацию изображения с последующей скелетизацией для анализа сетевых компонентов (). Измеряемыми параметрами были замкнутые сети, сетевые области, узлы, ответвления, длина ответвления, узлы с тройным разветвлением и узлы с четырьмя разветвлениями ().Эти параметры были выбраны для оценки сетевой структуры и связности из-за использования в предыдущих исследованиях или их описательного характера (27). Используя покадровую съемку в сочетании с KAV, было сделано несколько интересных наблюдений. Закрытые сети увеличивались в течение первых 4–5 часов и затем уменьшались (), предполагая, что формирование сети происходит в двух различных фазах. Одновременно с этим сначала уменьшалась средняя площадь сети, а затем увеличивалась площадь сети (). Общее количество узлов и ветвей в общей структуре сети неуклонно уменьшалось в первые 10 часов, а затем стабилизировалось.Количественные параметры KAV предоставили подробную сводку сетевых компонентов; однако эти измерения не оценивают возможность подключения узлов. Учитывая наблюдение нестабильных или «разорванных» соединений ветвей в некоторых образцах ECFC, программное обеспечение KAV было запрограммировано на вычисление отношения количества ветвей к узлам в качестве оценки сетевого подключения. KAV определил, что соотношение ветвей к узлам уменьшилось в первые 5 часов по мере увеличения возможности подключения к сети, а затем осталось неизменным с 5 до 10 часов, когда структура сети стала стабильной ().Через 10 ч отношение ветвей к узлам немного увеличилось, что свидетельствует о сгущении узлов и дестабилизации ветвей. В целом, 5-часовая постплейтинг была определена как критический момент в формировании сети и представляла собой время максимального подключения к сети. К 5 часам основные компоненты сети были установлены с последующими изменениями в структуре, свидетельствующими о стабильности структуры и / или ремоделировании. Идентификация этого критического момента времени послужила основой для последующих исследований, так что первые 5 часов обозначаются как , фаза 1 , а 5–10 часов – как , фаза 2, . Воспроизводимость была подтверждена путем оценки одного образца ECFC в течение нескольких дней (). Для подтверждения точности было проведено сравнение традиционного метода ручной оценки и KAV. Общее количество сетей и узлов, идентифицированных KAV, было сопоставимо с подсчетом вручную (данные не показаны). KAV обнаружил немного больше ветвей, чем определил вручную (). Учитывая сложность оценки> 200 ветвей на лунку, это наблюдение предполагает, что KAV может быть более чувствительным. Таким образом, этот новый проверенный аналитический метод обеспечивает продольную оценку васкулогенного потенциала, которого в настоящее время не хватает традиционным статическим методам количественной оценки.Более того, этот подход выявил динамические изменения в структуре сети с переходом через 5 часов, что может дать новое понимание механизмов васкулогенеза. После проведения расширенных оценок функции ECFC, KAV применяли к ECFC, подвергшимся воздействию материнского СД2 внутриутробно, для дальнейшего выявления функционального дефицита (23). KAV продемонстрировал, что сложность сетевых структур качественно и количественно различается между ECFC от неосложненной беременности и беременности с сахарным диабетом 2 типа (и Дополнительное видео S1; Дополнительный материал к этой статье доступен онлайн на веб-сайте журнала).Качественно, ECFC от беременностей T2DM образуют меньше закрытых сетей и имеют большие сетевые зоны по сравнению с ECFC от неосложненных беременностей (). Эти наблюдения были подтверждены количественным анализом КАВ (). Снижение более тонких фенотипов, таких как общее количество узлов и общее количество ветвей, также было выявлено с помощью KAV для ECFC, подвергшихся воздействию СД2 (2). Кроме того, в ECFC, подверженных воздействию T2DM, наблюдались снижение стабильности сети или увеличение числа оборванных соединений ответвлений во время фазы 2 .Количественная оценка, проведенная KAV, подтвердила, что соотношение ветвей к узлам, мера связности, увеличивается в ECFC, подверженных T2DM, с наибольшими различиями в фазе 2 . Это говорит о том, что не только ECFC от беременностей T2DM образуют меньше сетей в фазе 1 , но и сформированные сетевые соединения не поддерживаются. Например, образцы UC ECFC показали самое высокое отношение ветвей к узлам в фазе 1 , непосредственно перед формированием максимальной сети. Напротив, ECFC от беременностей с T2DM достигали максимального отношения ветвей к лимфатическим узлам чаще в фазе 2 ( P = 0.005), что свидетельствует о более высокой частоте разрывов соединений и конденсации сетей. ECFC от беременностей T2DM демонстрируют нарушение формирования сети. A : показаны типичные фазово-контрастные изображения ECFC, нанесенных на матригель с шагом 5 ч, начиная с момента нанесения покрытия ( t = 0). ECFC были получены при неосложненных беременностях (UC) и беременностях, осложненных T2DM. Масштабная линейка представляет 500 мкм. B : Программа кинетического анализа васкулогенеза (KAV) количественно оценивала закрытые сети, сетевые области, узлы, ветви и отношение общего количества ветвей к общему количеству узлов для беременностей с UC (●) и T2DM (○).Проиллюстрированные данные представляют собой средние значения ± стандартная ошибка 10 отдельных образцов ECFC из каждой экспериментальной группы. C : различия между средними кинетическими кривыми двух экспериментальных групп для каждого параметра показаны сплошными черными линиями с 95% доверительным интервалом (ДИ), представленным пунктирными линиями. Существенная разница между кривыми для определенного момента времени обнаруживается, если CI кривой различия не пересекает опорную линию ( y = 0) в этот момент времени. Для тщательной оценки изменений выборок T2DM были рассчитаны предполагаемые различия между покадровыми данными (). Статистическая значимость существует между группами неосложненных и T2DM, когда оцененная разница (предел достоверности ± 95%) не пересекает контрольную линию ( y = 0). Эти анализы показывают, что для большей части 15-часового курса были обнаружены значительные различия между данными неосложненного и СД2 по всем параметрам КАВ. Подобно качественным наблюдениям, наибольшая разница между кривыми (самая дальняя точка от опорной линии) для области сети и отношения ответвлений к узлам наблюдается в фазе 2 .Общее количество закрытых сетей, узлов и ответвлений первоначально достигает пика около 5 часов, а затем выравнивается, что позволяет предположить, что различия в параметрах KAV зависят от фазы. В совокупности эти результаты подтверждают, что ECFC, подверженные T2DM, образуют меньше закрытых сетей, узлов и ветвей, но развивают более крупные сетевые области и повышенное соотношение ветвей к узлам по сравнению с ECFC от неосложненных беременностей. Тканевая цитометрия позволяет количественно определить частоту и локализацию ECFC. Нарушение васкулогенного потенциала может быть связано с измененной пролиферацией, выживаемостью и / или миграцией, что затрудняет оценку фенотипов in situ из-за полутвердой природы матрицы, используемой для исследований in vitro.Чтобы устранить это техническое препятствие, были разработаны методы иммунофлуоресценции для оценки пролиферации и миграции. Первоначально, чтобы улучшить визуализацию ключевых клеточных компонентов (то есть цитоскелета и ядра), сети ECFC были зафиксированы, проницаемы и окрашены анти-α-тубулином и NucBlue для получения изображений с высоким разрешением с использованием конфокальной микроскопии. Интересно, что деление ECFC наблюдалось как в узлах, так и в ветвях (). Для количественного определения частоты и локализации деления ECFC было разработано программное обеспечение TC.В этом приложении иммунофлуоресценция тубулина генерировала карту евклидовых расстояний, которая представляла ширину сетевой структуры (). Высокая интенсивность NucBlue была запрограммирована на распознавание митотических клеток. Карта расстояний в сочетании с интенсивностью NucBlue позволила идентифицировать митотические клетки, локализованные внутри ветви (тонкие <60 пикселей) или узла (толстые> 60 пикселей;, вставок 1 и 2 ). TC позволил выполнить стробирование определенных популяций в образце на основе локализации и флуоресценции NucBlue.Методология TC была подтверждена в течение 3 дней с использованием нескольких образцов ECFC (). Важно отметить, что эти анализы проводились на целых лунках, что позволило проводить одновременный крупномасштабный количественный анализ тысяч клеток in situ по всей сети. Тканевая цитометрия позволяет количественно оценить частоту и локализацию пролиферирующих ECFC на матригеле. A : ECFC помещали на матригель в течение 5 часов, затем фиксировали и окрашивали на α-тубулин (серый) и NucBlue (голубой). Показаны репрезентативные микрофотографии делящихся клеток в узле и ветви.Масштабная линейка представляет 30 мкм. B : иммунофлуоресцентную визуализацию проводили на всех лунках ( слева , репрезентативное изображение, масштабная линейка = 500 мкм). Анализ тканевой цитометрии (TC) генерировал наложение на основе иммунофлуоресценции α-тубулина (, средний ), который использовался для количественного определения ширины сети и различения структур узлов и ветвей. Митотические клетки, выделенные красным, находились в ветвях (, вставка 1, ) и узлах (, вставка 2, ). Интегрированная ширина сети TC и интенсивность флуоресценции NucBlue для создания диаграмм рассеяния ( справа, ), которые включали все клетки, обнаруженные в сети ( n = 4733 клетки).Гейтинг идентифицировал митотические клетки внутри ветвей (, ворота 1, ) и узлов (, ворота 2, ). Масштабные линейки представляют 500 мкм (панели слева и посередине ) и 50 мкм ( вставка 1 ). C : процент общего количества ECFC ( слева, ) и процент митотических ECFC ( справа, ), расположенных в узлах или ветвях, был определен TC для трех независимых образцов ECFC в течение 3 дней (S1, образец 1 ; S2, образец 2 ; S3, образец 3 ).Отдельные точки представляют данные за разные дни. Показаны средние ± SD. D : процент от общего количества ECFC ( слева, ) и процент митотических ECFC ( справа, ), расположенных в узлах или ветвях, был определен для экспериментальных групп UC и T2DM. Графики представляют собой средние значения ± стандартное отклонение (отдельные точки представляют собой уникальный образец ECFC). После разработки метода TC для оценки делящихся клеток была оценена пролиферация ECFC от беременностей T2DM. 5-часовой момент времени был выбран на основе результатов KAV, указывающих время для максимальных замкнутых сетей.Большинство ECFC из обеих экспериментальных групп были локализованы в узлах (~ 75% клеток, включая делящиеся и неделящиеся;) и разделялись с одинаковой скоростью (UC, 4,1 ± 2,4%; T2DM, 4,5 ± 2,8%; n = 9 , UC; n = 7, T2DM). Разделение ECFC в обеих группах было в основном расположено внутри узлов (75%) по сравнению с филиалами (25%), что указывает на равную склонность к разделению независимо от местоположения в сети. Подобно данным TC, пролиферация ECFC не различалась между T2DM и неосложненными образцами, определенными с помощью проточной цитометрии (данные не показаны).Следовательно, ни локализация ECFC, ни внутриутробное воздействие T2DM не повлияли на вероятность деления ECFC на раннем этапе формирования сети. Fiji TrackMate оценивает подвижность ECFC на уровне отдельных клеток. Для кинетической оценки подвижности ECFC был разработан подход покадровой визуализации для отслеживания движения клеток во время васкулогенеза in vitro. Система доставки бакуловирусов пометила ядра ECFC с помощью GFP, чтобы обеспечить отслеживание отдельных клеток с помощью Fiji TrackMate (; 35). Качественно отдельные ячейки собраны в примитивные сетевые структуры в фазе 1 , в то время как более скоординированные движения ячеек были визуализированы в фазе 2 , поскольку ECFC составляли более крупные сетевые структуры.Кумулятивное движение клеток суммируется в треках, представляющих смещение или скорость отдельных клеток (и дополнительное видео S2). Номера ячеек, идентифицированные TrackMate, были эквивалентны в фазе 1 ( P = 0,75) и фазе 2 ( P = 0,28). Кроме того, TrackMate проанализировал аналогичное количество треков для групп без осложнений и T2DM в фазе 1 и фазе 2 ( P = 0,79 и P = 0,23, соответственно).Вместе эти наблюдения предполагают равную плотность посева и выживаемость ECFC в экспериментальных группах. Более того, количество отдельных ECFC, проанализированных в группах без осложнений и СД2, было сопоставимым. Подвижность ECFC оценивали во время формирования сети с помощью Fiji TrackMate. A : репрезентативная микрофотография ядер ECFC, меченных GFP, сразу после нанесения на матригель. Флуоресценция GFP показана серым цветом. B : сигнал GFP использовался для сегментации отдельных ECFC в TrackMate.ECFC, идентифицированные системой, выделены зелеными кружками. C : серии флуоресцентных изображений, полученных с течением времени, анализировали как стопки с помощью Fiji TrackMate. TrackMate создает пути, показанные зеленым цветом, которые представляют общее движение клеток за интервал визуализации (показано 10 часов). D – F : отдельные пути ECFC имеют цветовую кодировку с помощью программного обеспечения на основе таких переменных, как смещение ( D ), максимальная скорость ( E ) и средняя скорость ( F ).Цветовые шкалы указывают диапазоны смещения или скорости, при этом высокие значения отображаются оранжевым / красным цветом, а низкие значения – синим. Масштабная линейка представляет 500 мкм. Используя этот подход, оценивали три параметра моторики: смещение, среднюю скорость и максимальную скорость. Каждый параметр положительно коррелировал с другими в неосложненных, а также подверженных T2DM ECFC (; все значения P <0,05). Положительные корреляции между смещением и скоростью демонстрируют, что более быстро движущиеся ECFC также перемещаются дальше, предполагая, что движение ECFC координируется во время формирования сети. Таблица 3. Корреляция параметров подвижности UC T2DM Фаза 1 макс. –0,651) 0,65 (0,645–0,662) Рабочий объем в зависимости от средней скорости 0,51 (0,495–0,516) 0,50 (0,486–0,509) Рабочий объем в зависимости отмакс. скорость 0,26 (0,251–0,278) 0,25 (0,235–0,263) Фаза 2 Средняя скорость в сравнении с максимальной скоростью 0,69 (9000–0,70811) 0,67 (0,657–0,681) Рабочий объем в зависимости от средней скорости 0,46 (0,449–0,479) 0,53 (0,512–0,544) Рабочий объем в зависимости от максимальной скорости 0,27 (0,256–0,291) 0,33 (0.306–0,345) В фазе 1 ECFC демонстрируют повышенное смещение и скорость по сравнению с ECFC в фазе 2 ( P = 0,0001 и P = 0,0002, соответственно), что свидетельствует о большем движении клеток происходит на ранней стадии формирования сети. Были созданы линейные модели, чтобы определить, сохраняется ли средняя подвижность ECFC в фазе 1 в фазе 2 . Оценки с использованием линейных моделей показывают, что величина смещения, средняя скорость и максимальная скорость положительно коррелировали между фазой 1 и фазой 2 ().Эти анализы подтверждают, что образцы с большим смещением и скоростью в фазе 1 продолжают демонстрировать более высокие смещение и скорость в фазе 2 . Таблица 4. Параметры подвижности фаз 1 и 2 80 8 Смещение Фаза 1 Фаза 2 Наклон Стандартная ошибка P Значение 0.4747 0,1279 0,0026 Средняя скорость Рабочий объем 4326,2 1506,3 0,0131 Средняя скорость Средняя скорость 11 0,5711 9 Макс.скорость 1,5891 0,6615 0,0319 Макс.скорость Рабочий объем 1772,7 785.03 0,0418 Макс.скорость Средняя скорость 0,3745 0,0863 0,0008 Макс. моторика в группах неосложненного и СД2 была неоднородной. Некоторые ECFC демонстрируют снижение подвижности, на что указывает уменьшение смещения (). Однако этот фенотип не всегда был репрезентативным для одной клинической группы.После статистического анализа не было обнаружено различий в смещении, средней скорости или максимальной скорости между группами без осложнений и T2DM в фазе 1 или фазе 2 (). ECFC демонстрируют широкий диапазон подвижности. A : покадровые изображения формирования сети были получены в течение 10 часов. Смещение ECFC оценивалось отдельно для фазы 1 (0–5 часов) и фазы 2 (5–10 часов). Показаны данные шести образцов ECFC, подвергшихся воздействию UC и шести T2DM.Цветной путь представляет полное смещение, большее смещение указано оранжевым / красным цветом, а меньшее смещение – синим. Цветовая шкала несложная 1 (UC 1), верхний правый угол. Масштабная линейка представляет 500 мкм. B : гистограммы представляют частоту смещения ECFC, среднюю скорость и максимальную (максимальную) скорость в фазах 1 и 2 для образцов UC (черный) и T2DM (красный). Приблизительно 35000 отдельных ECFC были проанализированы для фазы 1 ( n = 20 образцов, 10 UC и 10 T2DM), и 20000 отдельных ECFC были проанализированы для фазы 2 ( n = 15, 8 UC и 7 T2DM). . Интеграция данных для улучшения понимания механизмов васкулогенеза. Анализы KAV, TC и подвижности оценивают функцию ECFC в одном контексте формирования сети. Сила этого подхода – идентификация коррелированных фенотипов, которые способствуют нарушению васкулогенной функции ECFC, и потенциальное открытие вовлеченных механизмов. Корреляция данных TC () с данными KAV () показала, что образцы ECFC с повышенным делением клеток в ветвях образовывали меньше закрытых сетей ( r = -0.50, P = 0,048). KAV показал, что некоторые образцы ECFC быстро достигли максимального числа сетей, в то время как другие образцы показали задержку максимального формирования сети. Следовательно, чтобы оценить, влияет ли локализованное деление клеток на скорость формирования сети, было проанализировано время до максимума сетей. ECFC с увеличенным разделением ветвей достигли максимальных сетей быстрее, чем образцы с меньшим разделением ветвей ( r = -0,51, P = 0,044). Эти данные предполагают, что увеличенное разделение филиалов и более быстрое формирование сети приводят к общему сокращению общего количества сетей.Кроме того, была обнаружена связь между КАВ и данными о моторике. Уменьшение смещения ECFC и средней скорости в фазе 1 были связаны с более высоким соотношением ветвей к узлам ( r = -0,85, P = 0,039 и r = -0,64, P = 0,035, соответственно. ). Точно так же ECFC с уменьшенным смещением в фазе 2 также имели более высокое соотношение ветвей к узлам, хотя и не статистически значимо ( r = -0,27, P = 0.11). Важно отметить, что эти результаты показывают, что ECFC, которые перемещаются на меньшее расстояние или с меньшей скоростью, имеют более высокое соотношение ветвей к узлам, что указывает на снижение сетевого подключения (). Схема моделей сетевого взаимодействия фенотипов T2DM ECFC. A : модельная сетевая структура, состоящая из 26 ветвей и 13 узлов, полностью соединена для создания 1 непрерывной структуры. Из-за непрерывности структуры, даже если каждый узел имеет от трех до четырех ветвей, отношение ветвей к узлам равно 2. B : показана та же структура сети, но с разрывами в двух ветвях (стрелки). Больше не является непрерывной структурой, количество ветвей, идентифицированных KAV, увеличивается на 2, что приводит к увеличению отношения количества ветвей к узлам до 2,15. Снижение сетевых подключений приводит к разрывным структурам, что увеличивает соотношение ветвей к узлам. Сетевые структуры не в масштабе. C : показаны репрезентативные фазово-контрастные изображения из экспериментальных групп UC и T2DM. Таким образом, наши данные поддерживают модель, согласно которой в фазе 1 образцы T2DM демонстрируют уменьшение количества закрытых сетей, узлов и ответвлений, что приводит к увеличению сетевых областей.Эти изменения в раннем формировании сети способствуют общему снижению стабильности сети, что приводит к увеличению отношения ответвлений к узлам в фазе 2 , изменения указывают на снижение возможности подключения к сети. Масштабные линейки соответствуют 500 мкм. ОБСУЖДЕНИЕ Достижения в технологии обработки изображений поставили новые задачи для обработки изображений и количественного анализа. Эти проблемы включают управление большими объемами данных и получение новых биологически значимых результатов, которые не зависят от ручного анализа (14).Поэтому разработка автоматизированного анализа изображений имеет решающее значение для максимизации информации, полученной в результате независимых экспериментов, и предоставления возможностей для обнаружения новых патологических фенотипов. Автоматизация позволяет проводить многопараметрические исследования широкого спектра количественных показателей, которые слишком сложно обнаружить вручную или с помощью ранее установленных методов (2, 12, 14). Кроме того, автоматизация может повысить чувствительность и воспроизводимость анализа, сводя к минимуму время, трудозатраты и систематическую ошибку.При изучении васкулогенеза автоматизация анализа изображений позволяет лучше понять механизм сложного кинетического процесса формирования сети. Хотя некоторые автоматизированные васкулогенные анализы изображений коммерчески доступны, многие технологии недоступны для крупных кинетических исследований (42). Следовательно, основным ограничением в этой области является платформа с открытым исходным кодом для оценки кинетических измерений васкулогенеза in vitro. Новые методы были оптимизированы для кинетической оценки функции ECFC и выявления корреляционных васкулогенных фенотипов.KAV измерил множество структурных фенотипов, определив две фазы формирования сети. Точка перехода между фазами была связана с максимальным подключением к сети. Кроме того, KAV рассчитал новую и прямую меру связности – соотношение ветвей к узлам. Анализ кинетической подвижности определил, как движение отдельных клеток влияет на формирование сети. Более сильное движение произошло во время раннего формирования сети, и движение в фазе 1 напрямую коррелировало с движением фазы 2 .Будущие исследования, которые оценивают направленность клеточного движения, важны для определения того, реагируют ли ECFC на побуждающие стимулы скоординированными движениями. В целом, эти улучшения стандартных методов визуализации и количественного анализа дают представление о потенциальных механизмах, способствующих измененному васкулогенезу, и могут быть применены к любой сосудистой системе или типу клеток. Оценка пролиферации по ядерным маркерам, таким как фосфорилирование гистона h4, является стандартной методикой. Однако оценка распространения во время формирования сети – дело новое.TC позволил идентифицировать отдельные популяции клеток на основе флуоресценции и локализации. Таким образом, TC является инновационным и мощным инструментом для оценки множества клеточных событий, таких как пролиферация, апоптоз и старение в большом количестве клеток. В частности, мы применили этот метод для количественной оценки локализации пролиферирующих ECFC в сетях с разрешением одной клетки. TC показал, что немногие ECFC делятся (2-8%) на раннем этапе формирования сети. Разделение ECFC происходит в основном в узлах, где находится большинство ячеек; однако ECFC в филиалах имеют аналогичную склонность к разделению.Важно отметить, что этот подход TC может быть применен к любому клеточному событию или экспрессии белка, которые могут быть помечены флуоресцентной меткой. Таким образом, потенциальное влияние применения этой недавно разработанной методологии к уникальным биологическим системам еще предстоит реализовать. Оценка нескольких фенотипов в одной биологической системе дает возможность идентифицировать корреляционные фенотипы. В нашей системе были выявлены отрицательные корреляции между параметрами KAV и данными TC. Образцы с более высоким числом филиалов быстро сформировали максимально закрытые сети, хотя в целом закрытых сетей было меньше.Параметры KAV также коррелировали с моторикой ECFC. В частности, ECFC, которые перемещаются на меньшие расстояния или с меньшей скоростью во время раннего формирования сети, имеют более высокое соотношение ветвей к узлам или ограниченную возможность подключения. Мы предполагаем, что ECFC, которые перемещаются меньше, образуют меньшее количество узлов, что приводит к более длинным ветвям и снижению стабильности сети. Меньшее количество узлов и снижение стабильности сети (т. Е. Снижение возможности подключения) приведут к увеличению соотношения ветвей к узлам. Хотя модели in vivo обеспечивают более полное представление о васкулогенной функции (37), новые подходы, описанные для исследований in vitro, информативны, но не являются дорогостоящими, и могут служить ориентиром для будущих исследований in vivo.Конкретным примером является то, что отношение ветвей к узлам обычно не оценивается. Однако это был фенотип, наиболее сильно коррелировавший с подвижностью ECFC и один из наиболее информативных фенотипов в дифференциации васкулогенной функции ECFC. На основе этих находок будущие исследования, которые сосредоточены на понимании основы повышенного соотношения ветвей и узлов, могут быть очень поучительными и способствовать механистическому пониманию измененного васкулогенеза. Кроме того, представленные результаты автоматизированного анализа изображений могут быть применены к моделям in vivo, что расширяет потенциальное влияние наличия этих аналитических ресурсов с открытым исходным кодом. Разработанные методы были реализованы для определения того, как воздействие материнской среды T2DM влияет на формирование сети ECFC. Эти новые данные подтверждают предыдущие данные о том, что ECFC, подверженные внутриутробному T2DM, нарушают васкулогенез (23). Однако покадровая визуализация идентифицировала две фазы васкулогенеза, которые ранее не оценивались. Методология KAV продемонстрировала, что ECFC подвержены T2DM в утробной форме (, фаза 1, ) и поддерживают меньшее количество сетей (, фаза 2, ), что приводит к увеличению средней площади сети.В T2DM ECFC предполагается, что начало патологического увеличения отношения ответвлений к узлам в фазе 2 указывает на нестабильность сети или неспособность поддерживать соединения ответвлений. Интересно, что две пробы ECFC для T2DM ( T2DM 2 и T2DM 3 ) были взяты от беременностей, при которых у матери был повышенный гемоглобин A1C, что указывает на плохой контроль глюкозы (). Эти образцы ECFC имели усиленный фенотип КАВ по сравнению со средними показателями СД2 (данные не показаны). Эти наблюдения предполагают, что измерения, полученные с помощью КАВ, могут коррелировать с тяжестью воздействия СД2 внутриутробно. Удивительно, но пролиферация и подвижность ECFC не различались между группами ECFC без осложнений и T2DM, предполагая, что различия в сетевой структуре не могут быть связаны с этими фенотипами. С другой стороны, эти неожиданные результаты могут быть связаны с изменчивостью выборки T2DM, разрешением метода или относительно низким размером выборки. Кроме того, эти результаты могут быть объяснены различиями между функциональными оценками на популяционной основе и отдельными измерениями ECFC. Например, популяционный анализ KAV выявил различия между клиническими группами.Последующие исследования ECFC (т.е. пролиферации и подвижности) проводились с разрешением отдельных клеток. Однако, как обсуждалось выше, фенотипы одноклеточных коррелировали с показателями формирования сети. Следовательно, незначительные изменения в одной функции ECFC могут повлиять на общую координацию соты, необходимую для оптимального формирования сети. Предполагается, что будущие исследования, которые коррелируют функции отдельных клеток с показаниями популяций, позволят лучше понять сложный процесс васкулогенеза. Исследования с использованием первичных стволовых клеток / предшественников человека дают возможность получить клинически значимые данные.Однако человеческие образцы вносят разнообразие, что может стать препятствием для выявления различий между группами с небольшими размерами выборки. В целом, большая вариабельность наблюдалась в образцах T2DM, что согласуется с гипотезой о том, что образцы ECFC от матерей T2DM являются гетерогенными с различной функциональностью из-за таких факторов, как тяжесть заболевания и терапевтические методы, используемые во время беременности (9, 23). Таким образом, необходимы более точные считывания, чтобы обозначить значимые различия в заболевании со значительной неоднородностью. Новые микроскопические подходы были оптимизированы, чтобы обеспечить лучшее понимание механизмов динамического процесса васкулогенеза. KAV идентифицировал две фазы формирования сети и руководил дальнейшими механистическими исследованиями пролиферации и подвижности, которые коррелировали с параметрами структуры сети. Эти корреляции позволяют по-новому взглянуть на то, как васкулогенез ECFC у новорожденных может быть изменен в результате воздействия внутриутробного СД2. Важно отметить, что описанные методы имеют широкое применение, выходящее за рамки описанных здесь.Внедрение этих подходов улучшит механистическую оценку и улучшит функциональные показания васкулогенеза в многочисленных типах клеток или болезненных состояниях. ГРАНТЫ Эта работа была поддержана грантами Национального института здравоохранения R01-HL-094725, P30-CA-82709 и U10-HD-063094, а также Детским фондом Райли. Кроме того, эта публикация стала возможной при частичной поддержке премии Национального института сердца, легких и крови T32-HL-007910. Спонсоры контрактных грантов – Национальные институты здравоохранения, контрактные гранты R01-HL-094725 (L.S. Haneline), P30-CA-82709 (Онкологический центр Саймона при Университете Индианы), U10-HD-063094 (LS Haneline), UL1-TR-001108 (CR Gohn) и T32-HL-007910-15 (KM Varberg) и Детский фонд Райли, Индианаполис, Индиана (LS Haneline). РАСКРЫТИЕ ИНФОРМАЦИИ Автор (ы) не заявляет о конфликте интересов, финансовом или ином. ВЗНОС АВТОРОВ K.M.V., E.K.B., and L.S.H. задумал и разработал исследование; К.М.В. и С. проведенные эксперименты; К.M.V., S.W., C.C., W.T., E.K.B. и L.S.H. проанализированные данные; K.M.V., S.W., E.K.B., C.R.G., K.W.D. и L.S.H. интерпретированные результаты экспериментов; K.M.V., S.W. и C.C. подготовленные фигурки; К.М.В. и С. составленная рукопись; K.M.V., S.W., C.C., W.T., E.K.B., C.R.G. и L.S.H. отредактированная и исправленная рукопись; K.M.V., S.W., C.C., W.T., E.K.B., C.R.G., K.W.D. и L.S.H. утверждена окончательная версия рукописи. БЛАГОДАРНОСТИ Авторы благодарят Люси Миллер, Линн Эрнандес, доктора Дэвида Хааса и Бриттани Йели (Медицинский факультет Университета Индианы), доктораКарен Поллок, Джули Мунд, Мэтью Репасс и Эмили Симс (Angio BioCore в Центре рака Саймона Университета Индианы), а также Ридди Шукла и Лорен Кнеллер (Школа медицины Университета Индианы) за отличную техническую помощь. Авторы также благодарят докторов наук. Морин Харрингтон, Эдвард Сроур, Ричард Дэй, Мервин Йодер и Маттиас Клаусс (Медицинский факультет Университета Индианы) за научное обсуждение, а также Дженис Уоллс (Медицинский факультет Университета Индианы) за административную поддержку. Все изображения были выполнены в Центре биологической микроскопии Индианы, Медицинской школе Университета Индианы. ССЫЛКИ 2. Allier CP, Kesavan SV, Coutard JG, Cioni O, Momey F, Navarro F, Menneteau M, Chalmond B, Obeid P, Haguet V, David-Watine B, Dubrulle N, Shorte S., van der Sanden B, Di Natale C, Hamard L, Wion D, Dolega ME, Picollet-D’hahan N, Gidrol X, Dinten JM. Видеообъективная микроскопия 2D и 3D культур клеток. В: Proceedings of SPIE, Imaging, Manipulation, and Analysis of Biomolecules, Cells, and Tissues XII , под редакцией Farkas DL, Nicolau DV и Leif RC. Сан-Франциско, Калифорния: SPIE, 2014, т.8947, стр. 89471H. DOI: 10.1117 / 12.2038098. [CrossRef] [Google Scholar] 3. Арганда-Каррерас I, Фернандес-Гонсалес Р., Муньос-Баррутия А., Ортис-де-Солорсано К. Трехмерная реконструкция гистологических срезов: приложение к ткани молочной железы. Microsc Res Tech 73: 1019–1029, 2010. DOI: 10.1002 / jemt.20829. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 4. Арнаутова И., Клейнман Х.К. Ангиогенез in vitro: образование трубок эндотелиальных клеток на гелеобразном экстракте базальной мембраны. Нат Проток 5: 628–635, 2010. DOI: 10.1038 / nprot.2010.6. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 5. Асахара Т. Клеточная терапия и генная терапия с использованием эндотелиальных клеток-предшественников для регенерации сосудов. Handb Exp Pharmacol 180: 181–194, 2007. DOI: 10.1007 / 978-3-540-68976-8_8. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 6. Асахара Т., Мурохара Т., Салливан А., Сильвер М., ван дер Зи Р., Ли Т., Витценбихлер Б., Шаттеман Г., Иснер Дж. М.. Выделение предполагаемых эндотелиальных клеток-предшественников для ангиогенеза. Наука 275: 964–967, 1997. DOI: 10.1126 / science.275.5302.964.[PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 7. Авогаро А., Альбьеро М., Менегаццо Л., де Кройценберг С., Фадини Г.П. Эндотелиальная дисфункция при диабете: роль репаративных механизмов. Уход за диабетом 34, Приложение 2: S285 – S290, 2011. doi: 10.2337 / dc11-s239. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 9. Блю Е.К., ДиДжузеппе Р., Дерр-Йеллин Е., Акоста Дж. К., Pay SL, Ханенберг Х., Шеллингер М.М., Куинни С.К., Мунд Дж. А., Дело J, Ханелин Л.С. Гестационный диабет вызывает изменения в функции неонатальных эндотелиальных колониеобразующих клеток.Педиатр Рес 75: 266–272, 2014. DOI: 10.1038 / pr.2013.224. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 10. Бони CM, Верма A, Такер R, Vohr BR. Метаболический синдром в детстве: связь с массой тела при рождении, материнским ожирением и гестационным сахарным диабетом. Педиатрия 115: e290 – e296, 2005. DOI: 10.1542 / peds.2004-1808. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 11. Боргези А., Гарофоли Ф., Кабано Р., Циалла С., Боллани Л., Стронати М. Циркулирующие эндотелиальные клетки-предшественники и болезни недоношенных детей.Минерва Педиатр 62, Suppl 1: 21–23, 2010. [PubMed] [Google Scholar] 12. Брей М.А., Карпентер А.Е. CellProfiler Tracer: исследование и проверка данных изображений покадровой микроскопии с высокой пропускной способностью. BMC Bioinformatics 16: 368, 2015. DOI: 10.1186 / s12859-015-0759-x. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 13. Bunt JC, Tataranni PA, Salbe AD. Внутриутробное заражение диабетом является определяющим фактором гемоглобина A (1) c и систолического артериального давления у детей индейцев пима. J Clin Endocrinol Metab 90: 3225–3229, 2005.DOI: 10.1210 / jc.2005-0007. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 14. Карпентер А.Е., Джонс Т.Р., Лампрехт М.Р., Кларк С., Канг И.Х., Фриман О., Гертин Д.А., Чанг Дж.Х., Линдквист Р.А., Моффат Дж., Голланд П., Сабатини Д.М. CellProfiler: программное обеспечение для анализа изображений для определения и количественной оценки фенотипов клеток. Геном Биол 7: R100, 2006. DOI: 10.1186 / GB-2006-7-10-R100. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 17. Крэбтри Б., Субраманиан В. Поведение эндотелиальных клеток на матригеле и разработка метода быстрого и воспроизводимого анализа ангиогенеза in vitro.In vitro Cell Dev Biol Anim 43: 87–94, 2007. DOI: 10.1007 / s11626-007-9012-x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 18. Крисер П.Дж., Йодер М.С. Роль эндотелиальных колониеобразующих клеток в неоангиогенезе и восстановлении тканей. Пересадка органов Curr Opin 15: 68–72, 2010. DOI: 10.1097 / MOT.0b013e32833454b5. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 19. Дебнат Дж, Мутусвами СК, Брюгге Джонс. Морфогенез и онкогенез MCF-10A эпителиальных ацинусов молочной железы, выращенных в культурах трехмерных базальных мембран.Методы 30: 256–268, 2003. DOI: 10.1016 / S1046-2023 (03) 00032-X. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 20. Эгути М., Масуда Х., Асахара Т. Эндотелиальные клетки-предшественники для постнатального васкулогенеза. Clin Exp Nephrol 11: 18–25, 2007. DOI: 10.1007 / s10157-006-0448-1. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 21. Franks PW, Looker HC, Kobes S, Touger L, Tataranni PA, Hanson RL, Knowler WC. Гестационная толерантность к глюкозе и риск диабета 2 типа у молодых потомков индейцев пима. Диабет 55: 460–465, 2006. DOI: 10.2337 / диабет.55.02.06.db05-0823. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 22. Георгеску А. Сосудистая дисфункция при диабете: эндотелиальные клетки-предшественники как новая терапевтическая стратегия. Всемирный диабет J 2: 92–97, 2011. DOI: 10.4239 / wjd.v2.i6.92. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 23. Инграм Д.А., Лиен И.З., Мид Л.Е., Эстес М., Пратер Д.Н., Дерр-Йеллин Э., ДиМеллио Л.А., Ханелин Л.С. Гипергликемия in vitro или диабетическая внутриутробная среда снижает количество и функцию неонатальных эндотелиальных колониеобразующих клеток.Диабет 57: 724–731, 2008. DOI: 10.2337 / db07-1507. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 24. Инграм Д.А., Мид Л.Е., Мур Д.Б., Вудард В., Фенолио А., Йодер М.С. Эндотелиальные клетки, происходящие из стенки сосудов, быстро пролиферируют, потому что они содержат полную иерархию эндотелиальных клеток-предшественников. Кровь 105: 2783–2786, 2005. DOI: 10.1182 / blood-2004-08-3057. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 25. Инграм Д.А., Мид Л.Э., Танака Х., Мид В., Феноглио А., Мортелл К., Поллок К., Феркович М.Дж., Гилли Д., Йодер М.С. Идентификация новой иерархии эндотелиальных клеток-предшественников с использованием периферической и пуповинной крови человека.Кровь 104: 2752–2760, 2004. DOI: 10.1182 / blood-2004-04-1396. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 26. Джавед MJ, Mead LE, Prater D, Bessler WK, Foster D, Case J, Goebel WS, Yoder MC, Haneline LS, Ingram DA. Эндотелиальные колониеобразующие клетки и мезенхимальные стволовые клетки обогащаются в пуповинной крови человека на разных сроках беременности. Педиатр Рес 64: 68–73, 2008. DOI: 10.1203 / PDR.0b013e31817445e9. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 27. Khoo CP, Micklem K, Watt SM. Сравнение методов количественной оценки ангиогенеза в анализе матригеля in vitro.Tissue Eng Часть C Методы 17: 895–906, 2011. DOI: 10.1089 / ten.tec.2011.0150. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 28. Khoo CP, Pozzilli P, Элисон MR. Эндотелиальные клетки-предшественники и их потенциальные терапевтические применения. Regen Med 3: 863–876, 2008. DOI: 10.2217 / 17460751.3.6.863. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 29. Киртон Дж. П., Сюй К. Эндотелиальные предшественники в восстановлении сосудов. Microvasc Res 79: 193–199, 2010. DOI: 10.1016 / j.mvr.2010.02.009. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 30.Mead LE, Prater D, Yoder MC, Ingram DA. Выделение и характеристика эндотелиальных клеток-предшественников из крови человека. В: Текущие протоколы в биологии стволовых клеток, гл. 2, блок 2C.1, Хобокен, Нью-Джерси: Wiley, 2008. doi: 10.1002 / 9780470151808.sc02c01s6. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 31. Мукаи Н., Акахори Т., Комаки М., Ли К., Канаясу-Тойода Т., Исии-Ватабе А., Кобаяси А., Ямагути Т., Абэ М., Амагаса Т., Морита И. Сравнение потенциалов образования трубок ранних и поздних эндотелиальных клеток-предшественников.Exp Cell Res 314: 430–440, 2008. DOI: 10.1016 / j.yexcr.2007.11.016. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 32. Прасейн Н., Ли М.Р., Вемула С., Мидор Дж.Л., Йошимото М., Феркович М.Дж., Фетт А., Гупта М., Рапп Б.М., Саадазаде М.Р., Гинзберг М., Элемент О, Ли Й., Войтик-Харбин С.Л., Чунг Х.М., Гонконг К.С., Рид Э., О’Нил С.Л., Медина Р.Дж., Ститт А.В., Мерфи М.П., ​​Рафи С., Броксмайер Х.Э., Йодер М.С. Дифференциация плюрипотентных стволовых клеток человека в клетки, подобные эндотелиальным колониеобразующим клеткам пуповинной крови. Nat Biotechnol 32: 1151–1157, 2014.DOI: 10.1038 / NBT.3048. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 33. Prater DN, Case J, Ingram DA, Yoder MC. Рабочая гипотеза переопределения эндотелиальных клеток-предшественников. Лейкемия 21: 1141–1149, 2007. DOI: 10.1038 / sj.leu.2404676. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 35. Schindelin J, Arganda-Carreras I, Frize E, Kaynig V, Longair M, Pietzsch T, Preibisch S, Rueden C, Saalfeld S, Schmid B, Tinevez JY, White DJ, Hartenstein V, Eliceiri K, Tomancak P, Cardona A. Фиджи: платформа с открытым исходным кодом для анализа биологических изображений.Нат методы 9: 676–682, 2012. DOI: 10.1038 / nmeth.2019. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 36. Зиверт В., Тапио С., Брейнингер С., Гайпл Ю., Андрачке Н., Тротт К.Р., Мултхофф Г. Экспрессия молекул адгезии и функция первичных эндотелиальных клеток в доброкачественных и злокачественных тканях коррелируют с пролиферацией. PLoS One 9: e, 2014. doi: 10.1371 / journal.pone.00. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 37. Саймонс М., Алитало К., Приложение BH, Огюстин Х.Г., Луч C, Берк BC, Бызова Т., Кармелиет П., Чилиан В., Кук Дж. П., Дэвис Г. Э., Эйхманн А., Ируэла-Ариспе М. Л., Кешет Е., Синусас А. Дж., Рурберг С., Woo YJ, Dimmeler S; Совет Американской кардиологической ассоциации по основным сердечно-сосудистым наукам и Совет по сердечно-сосудистой хирургии и анестезии.Современные методы оценки ангиогенеза и васкуляризации тканей: научное заявление Американской кардиологической ассоциации. Circ Res 116: e99 – e132, 2015. doi: 10.1161 / RES.0000000000000054. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 38. Соломон I, О’Рейли М., Ионеску Л., Альфонс Р.С., Раджабали С., Чжун С., Вадивель А., Шелли В.К., Йодер М.С., Тебо Б. Функциональные различия между плацентарными микро- и макрососудистыми колониеобразующими клетками эндотелия. Стволовые клетки Transl Med 5: 291–300, 2016.DOI: 10.5966 / sctm.2014-0162. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 39. Васа М., Фихтльшерер С., Айхер А., Адлер К., Урбич С., Мартин Х., Цайхер А.М., Диммелер С. Количество и миграционная активность циркулирующих эндотелиальных клеток-предшественников обратно коррелируют с факторами риска ишемической болезни сердца. Circ Res 89: E1 – E7, 2001. DOI: 10.1161 / hh2301.093953. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 40. Ван И, Чен Кью, Чжан З, Цзян Ф, Мэн Х, Ян Х. Сверхэкспрессия интерлейкина-10 улучшает функцию эндотелиальных клеток-предшественников, стимулированных TNF-α, посредством активации сигнального пути STAT3.Инт Дж Мол Мед 35: 471–477, 2015. [PubMed] [Google Scholar] 41. Ватт С.М., Атанассопулос А., Харрис А.Л., Цакнакис Г. Эндотелиальные стволовые клетки / клетки-предшественники человека, ангиогенные факторы и восстановление сосудов. Интерфейс J R Soc 7: Приложение 6: S731 – S751, 2010. doi: 10.1098 / rsif.2010.0377.focus. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 43. Winfree S, Khan S, Micanovic R, Eadon MT, Kelly KJ, Sutton TA, Phillips CL, Dunn KW, El-Achkar TM. Количественная трехмерная тканевая цитометрия для изучения ткани почек и резидентных иммунных клеток.J Am Soc Nephrol (фев. 2, 2017). DOI: 10.1681 / ASN.20160 . [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 44. Вуд SN. Обобщенные аддитивные модели: введение с Р. Бока Ратон, Флорида: CRC, 2006. [Google Scholar] 45. Йодер М.С. Является ли эндотелий источником эндотелиальных клеток-предшественников? Артериосклер Thromb Vasc Biol 30: 1094–1103, 2010. DOI: 10.1161 / ATVBAHA.109.1. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 46. Йодер М.С., Мид Л.Е., Пратер Д., Криер Т. Добавить комментарий Отменить ответ Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены * Комментарий * Имя * Email * Сайт