Гуковский строительный техникум: Гуковский Строительный Техникум – Государственное бюджетное профессиональное образовательное учреждение Ростовской области

Адрес:

Удобный сервис подписки на получение свежих вакансий от работодателя.

государственное бюджетное профессиональное образовательное учреждение Ростовской области “Гуковский строительный техникум” официальный сайт вакансии

государственное бюджетное профессиональное образовательное учреждение Ростовской области “Гуковский строительный техникум” телефон отдел кадров

Время работы:
Регион: Ростовская область
Все номера телефонов предоставлены отделом кадров организации или центром занятости, подавшим объявление

Вакансии в государственное бюджетное профессиональное образовательное учреждение Ростовской области “Гуковский строительный техникум”

Каждая новая вакансия поступит к вам на email-почту.

Работа в государственное бюджетное профессиональное образовательное учреждение Ростовской области “Гуковский строительный техникум”

Профиль Fei-Fei Li | Стэнфордские профили

Био

Доктор Фей-Фей Ли – первый профессор секвойи на факультете компьютерных наук Стэнфордского университета и содиректор Стэнфордского института искусственного интеллекта, ориентированного на человека. С 2013 по 2018 год она занимала должность директора Стэнфордской лаборатории искусственного интеллекта. Во время своего творческого отпуска из Стэнфорда с января 2017 года по сентябрь 2018 года она была вице-президентом Google и главным научным сотрудником в области искусственного интеллекта / машинного обучения в Google Cloud. Доктор Фэй-Фэй Ли получил ее B.Имеет степень бакалавра физики в Принстоне в 1999 году с отличием и докторскую степень в области электротехники в Калифорнийском технологическом институте (Калифорнийский технологический институт) в 2005 году. Она присоединилась к Стэнфорду в 2009 году в качестве доцента. До этого она работала на факультете Принстонского университета (2007-2009) и Иллинойского университета Урбана-Шампейн (2005-2006).

Текущие исследовательские интересы доктора Фей-Фей Ли включают когнитивный ИИ, машинное обучение, глубокое обучение, компьютерное зрение и ИИ + здравоохранение, особенно окружающие интеллектуальные системы для оказания медицинских услуг.В прошлом она также занималась когнитивной и вычислительной нейробиологией. Доктор Ли опубликовал более 200 научных статей в ведущих журналах и на конференциях, включая Nature, PNAS, Journal of Neuroscience, CVPR, ICCV, NIPS, ECCV, ICRA, IROS, RSS, IJCV, IEEE-PAMI, New England Journal. of Medicine, Nature Digital Medicine и т. д. Доктор Ли является изобретателем ImageNet и ImageNet Challenge, важнейшего крупномасштабного набора данных и сравнительного анализа, который внес свой вклад в последние разработки в области глубокого обучения и искусственного интеллекта. В дополнение к ее техническому вкладу, она является ведущим национальным голосом, выступающим за разнообразие в STEM и AI. Она является соучредителем и председателем национальной некоммерческой организации AI4ALL, целью которой является повышение инклюзивности и разнообразия в образовании по искусственному интеллекту.

Доктор Ли является избранным членом Национальной инженерной академии (NAE), Национальной академии медицины (NAM) и Американской академии искусств и наук (AAAS). Она также является научным сотрудником ACM, членом Совета по международным отношениям (CFR), лауреатом премии IEEE PAMI Longuet-Higgins Prize 2019 года, премии Национального географического общества 2019 года, премии Athena Award 2017 за академическое лидерство, IAPR 2016 J.Премия К. Аггарвала, премия IEEE PAMI Марка Эверингема 2016 года, премия nVidia Pioneer in AI в 2016 году, премия для преподавателей IBM в 2014 году, премия Альфреда Слоана в 2011 году, награда Yahoo Labs FREP в 2012 году, награда NSF CAREER в 2009 году, новый факультет исследований Microsoft в 2006 году Товарищество, среди прочего. Доктор Ли является основным докладчиком на многих научных или влиятельных конференциях, включая Всемирный экономический форум (Давос), Конференцию Грейс Хоппер 2017 года и основную конференцию TED2015. Работа лаборатории доктора Ли была опубликована в различных журналах и газетах, включая New York Times, Wall Street Journal, Fortune Magazine, Science, Wired Magazine, MIT Technology Review, Financial Times и других.Она была выбрана журналом ELLE Magazine в качестве женщины-технолога 2017 года, премии Awesome Women Award 2017 года по версии Good Housekeeping, Global Thinker 2015 года по версии журнала Foreign Policy и одной из наград «Великие иммигранты: гордость Америки» в 2016 году по версии журнала Карнеги. Foundation, среди прошлых победителей – Альберт Эйнштейн, Йойо Ма, Сергей Брин и другие.

(д-р Ли издает под именем Л. Фей-Фэй)

IJMS | Бесплатный полнотекстовый | Ликопин подавляет воспалительные реакции, опосредованные окислительным стрессом, в клетках AR42J поджелудочной железы, стимулированных этанолом / пальмитолеиновой кислотой

1.Введение

Цели настоящего исследования заключались в следующем: (1) определить, индуцирует ли EtOH / POA активацию зимогена и экспрессию IL-6, которая опосредована продукцией ROS, опосредованной NADPH-оксидазой, в ацинарных клетках поджелудочной железы AR42J; и (2) определить, подавляет ли ликопин митохондриальную дисфункцию, активацию зимогена и экспрессию IL-6 путем подавления продукции ROS, опосредованной NADPH-оксидазой, в клетках AR42J. Кроме того, чтобы определить участие ROS и NADPH-оксидазы в EtOH / POA-индуцированных изменениях (активация NF-κB, активация зимогена и экспрессия IL-6), клетки обрабатывали антиоксидантом N-ацетилцистеином (NAC) и Ингибитор НАДФН-оксидазы 1 ML171 перед обработкой EtOH / POA.

3. Обсуждение

Несмотря на то, что ликопин ингибирует активность НАДФН-оксидазы в клетках, стимулированных EtOH / POA, уровни ROS в клетках, обработанных ликопином и EtOH / POA, все еще превышали уровни, указанные в необработанных клетках.Мы показываем, что обработка EtOH / POA стимулирует НАДФН-оксидазу в клетках AR42J. Однако он может активировать другие клеточные системы, продуцирующие АФК, локализованные на плазматической мембране, в цитозоле, в пероксисомах, в эндоплазматическом ретикулуме и так далее. Необходимы дальнейшие исследования для определения клеточных источников АФК в ацинарных клетках поджелудочной железы, обработанных EtOH / POA.

В настоящем исследовании мы показываем, что ликопин ингибирует активность НАДФН-оксидазы и, таким образом, снижает уровни АФК, что приводит к ингибированию активации NF-κB, экспрессии IL-6 и активации зимогена в клетках, стимулированных EtOH / POA. Поскольку большие количества АФК могут вызывать дисфункцию митохондрий, что определяется сниженным потенциалом митохондриальной мембраны и низким уровнем продукции АТФ, снижение АФК может быть связано с предотвращением митохондриальной дисфункции в ацинарных клетках поджелудочной железы, обработанных ликопином, подвергшихся воздействию EtOH / POA.

В заключение, потребление продуктов, богатых ликопином, может быть полезным для предотвращения или замедления развития алкогольного острого панкреатита за счет ингибирования продукции АФК, опосредованной НАДФН-оксидазой, и воспалительных реакций, вызванных окислительным стрессом, включая митохондриальную дисфункцию, активацию зимогена и ИЛ- 6 в ацинарных клетках поджелудочной железы.

4. Материалы и методы

4.1. Клеточная линия и условия культивирования

Линия ацинарных клеток поджелудочной железы крысы AR42J (панкреатома; ATCC CRL 1492) была получена из Американской коллекции типовых культур (Манассас, Вирджиния, США).Клетки выращивали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (Sigma, Сент-Луис, Миссури, США), с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (Gibco BRL, Гранд-Айленд, Нью-Йорк, США) и антибиотиков (100 Ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл). мл стрептомицина). Клетки инкубировали при 37 ° C в увлажненной атмосфере, состоящей из 95% воздуха и 5% CO ₂ .

4.2. Протокол эксперимента

Ликопин (L9879, Sigma-Aldrich) растворяли в тетрагидрофуране (THF). Клетки AR42J (2,0 × 10 ⁵ /2 мл / лунка) предварительно обрабатывали ликопином (конечная концентрация 0.1 или 0,2 мкМ) в течение 2 часов, а затем обрабатывали EtOH (150 мМ) / POA (50 мкМ) в течение 10 минут (для измерения внутриклеточных и митохондриальных уровней ROS, активности НАДФН-оксидазы, уровней ММП и АТФ), 20 минут (для анализ активации NF-κB и активации зимогена), 4 часа (для определения экспрессии мРНК IL-6) и 24 часа (для измерения уровней белка IL-6). Чтобы определить участие НАДФН-оксидазы и АФК, клетки предварительно обрабатывали ингибитором НАДФН-оксидазы 1 ML171 (2-ацетилфенотиазин, 2 мкМ) и NAC (1 мМ) за 1 час до стимуляции EtOH / POA.Клетки AR42J, инкубированные только с THF (менее 0,5%), служили контролем.

4.3. Приготовление клеточных экстрактов

Клетки (1,0 × 10 ⁶ клеток / 10 мл / чашку) в чашки для культивирования собирали с помощью трипсин-этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и осаждали центрифугированием при 1000 × g в течение 5 минут. Осадки ресуспендировали в буфере для лизиса, содержащем 25 мМ Трис (pH 7.4), 150 мМ NaCl, 1% Nonidet P-40 (NP-40), 0,5% дезоксихолата натрия, 0,1% додецилсульфата натрия (SDS) и коммерческий комплекс ингибиторов протеаз (Complete; Roche, Mannheim, Germany). Затем клетки лизировали, протягивая клетки через шприц объемом 1 мл несколькими быстрыми движениями. Затем смесь помещали на лед на 30 минут и центрифугировали при 10000 × g в течение 15 минут. Супернатанты собирали и использовали как экстракты целых клеток. Для приготовления мембранных фракций супернатанты дополнительно центрифугировали при 100000 × g в течение 1 ч при 4 ° C.Осадок ресуспендировали в буфере для лизиса, содержащем 50 мМ 4- (2-гидроксиэтил) -1-пиперазинэтансульфоновую кислоту (HEPES) (pH 7,4), 150 мМ NaCl, 1 мМ EDTA и 10% глицерин, чтобы получить фракции мембран. Для приготовления ядерных экстрактов клетки лизировали в гипотоническом буфере, содержащем 10 мМ HEPES, 1,5 мМ MgCl ₂ , 10 мМ KCl, 1 мМ DL-дитиотреитол (DTT), 0,5 мМ фенилметилсульфонилфторид (PMSF), 0,05% NP -40 и 0,1 мМ EDTA с последующим центрифугированием при 10000 × g в течение 10 мин.Осадки ядер ресуспендировали в буфере для экстракции ядер, содержащем 20 мМ HEPES (pH 7,9), 420 мМ NaCl, 0,1 мМ EDTA, 1,5 мМ MgCl ₂ , 25% глицерин, 1 мМ DTT и 0,5 мМ PMSF, а затем центрифугировали. Супернатанты собирали и использовали в качестве ядерных экстрактов. Концентрацию белка определяли методом Брэдфорда (Bio-Rad Laboratories, Геркулес, Калифорния, США).

4.4. Измерение внутриклеточных уровней АФК

Клетки (2,0 × 10 ⁵ клеток / 2 мл / лунку) в 6-луночных планшетах предварительно обрабатывали ликопином в течение 2 часов, а затем обрабатывали EtOH (150 мМ) / POA (50 мкМ) в течение 10 мин.Клетки, обработанные ликопином и EtOH / POA, обрабатывали 10 мкг / мл диацетата дихлорфлуоресцеина (DCF-DA; Sigma-Aldrich) и инкубировали в 5% CO ₂ /95% воздухе при 37 ° C в течение 30 минут. мин. После инкубации среду удаляли и клетки промывали PBS. Интенсивность флуоресценции 2 ‘, 7’-дихлорфлуоресцеина (DCF) в клетках (в 6-луночных планшетах) измеряли при 522 нм (возбуждение при 498 нм) с помощью счетчика с несколькими метками Victor 5 (PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Бостон, Массачусетс, США).Уровни внутриклеточных АФК были нормализованы по количеству клеток.

4,5. Измерение уровней митохондриальных ROS

Клетки (2,0 × 10 ⁵ клеток / 2 мл / лунка) в 6-луночных планшетах обрабатывали ликопином в течение 10 мин. Для оценки митохондриальных уровней ROS клетки обрабатывали 10 мкМ MitoSOX (Life Technologies, Гранд-Айленд, Нью-Йорк, США) в течение 30 минут перед промывкой и соскабливанием в фосфатно-солевой буфер (PBS). Интенсивность флуоресценции MitoSOX при 585 нм (возбуждение при 524 нм) измеряли с помощью счетчика с несколькими метками Victor 5 (PerkinElmer Life and Analytical Sciences).Уровни митохондриальных АФК были нормализованы по количеству клеток, и уровни АФК были оценены на основе равного количества клеток.

4.6. Измерение MMP

Для определения изменений в MMP клетки (1,0 × 10 ⁶ клеток / 10 мл / чашку) в культуральных чашках культивировали на стеклянных покровных стеклах, покрытых поли-L-лизином и предварительно обработанных ликопином в течение 10 мин. Затем клетки инкубировали с реагентом 5,5,6,6-тетрахлор-1,1,3,3-тетраэтилбензимидазолилкарбоцианина иодид (JC-1) (1: 100; 10009908, Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, США) на 20 мин.После удаления среды клетки сушили в течение 15 минут при 20–22 ° C, дважды промывали PBS в течение 5 минут и наносили на них монтажный раствор (M-7534, Sigma Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США). Флуоресценцию JC-1 в клетках определяли (красный цвет; возбуждение при 590 нм и испускание при 610 нм, зеленый; возбуждение при 485 нм и излучение при 535 нм) с использованием конфокального микроскопа с лазерным сканированием (LSM 880, Carl Zeiss Inc. , Оберкохен, Германия). Флуоресцентные изображения выражали как процентное соотношение интенсивностей красного и зеленого с использованием NIH ImageJ 5.0 (Национальные институты здравоохранения, Бетесда, Мэриленд, США).

4.7. Измерение уровней АТФ

АТФ измеряли с использованием люминесцентного набора для определения АТФ в соответствии с протоколом производителя (ab113849; Abcam, Кембридж, Великобритания). Клетки (2,0 × 10 ⁵ клеток / 2 мл / лунка) стимулировали в 6-луночных планшетах EtOH / POA в течение 10 мин, а затем к лиофилизированному субстрату АТФ добавляли субстратный буфер для приготовления раствора люминесцентного субстрата. Люминесценцию измеряли с помощью считывающего устройства для микропланшетов (Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния, США).Относительную концентрацию АТФ определяли путем интерполяции в пределах стандартного эталона АТФ.

4.8. Измерение активности НАДФН оксидазы

Активность НАДФН оксидазы измеряли с помощью анализа люцигенина. Для измерения активности НАДФН-оксидазы в экстрактах мембран клетки стимулировали EtOH / POA в течение 10 мин. Анализ проводили в буфере 50 мМ трис-N-морфолино) этансульфоновой кислоты (MES) (pH 7,0), содержащем 2 мМ цианид калия (KCN), 10 мкМ люцигенин и 100 мкМ NADPH.Реакцию инициировали добавлением 10 мкг экстракта мембранного белка. Эмиссию фотонов измеряли с использованием многометочного счетчика Victor5 (PerkinElmer Life and Analytical Sciences). Экстракт цитозольного белка использовали вместо экстракта мембранного белка в качестве контроля.

4.9. Анализ сдвига электрофоретической подвижности (EMSA)

Клетки обрабатывали ликопином в течение 20 мин. Ядерные экстракты (2 мкг) клеток инкубировали с ³² P-меченным двухцепочечным олигонуклеотидом 5′-GGGCCAAGAATCTTAGCAGTTTCGGG-3 ‘в буфере, содержащем 12% глицерина, 12 мМ HEPES (pH 7.9), 1 мМ EDTA, 1 мМ DTT, 25 мМ KCl, 5 мМ MgCl ₂ и 0,04 мкг / мл поли [d (I-C)] при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем экстракты подвергали электрофоретическому разделению при комнатной температуре на неденатурирующем 5% акриламидном геле при 30 мА с использованием 0,5-кратного буфера трисборат / ЭДТА. Гели сушили при 80 ° C в течение 1 часа и экспонировали на рентгеновской пленке в течение 24 часов при -70 ° C с усиливающими экранами.

4.10. Анализы активности ферментов

Клетки (1,0 × 10 ⁶ клеток / 10 мл / чашку) в чашках для культивирования обрабатывали EtOH / POA в течение 20 минут, собирали трипсин-EDTA и осаждали центрифугированием при 1000 × g в течение 5 мин.Осадки промывали PBS, а затем ресуспендировали в буфере для анализа, содержащем 50 мМ Трис (pH 8,0), 150 мМ NaCl, 1 мМ CaCl ₂ и 0,1% бычий сывороточный альбумин (BSA), и лизировали, протягивая клетки через 1 -мл шприц несколькими быстрыми ударами. Затем смесь центрифугировали при 10000 × g в течение 2 минут. Для анализа использовали супернатанты. Активность трипсина и химотрипсина измеряли флуорометрическим методом (возбуждение при 380 нм и испускание при 440 нм) с помощью многоцелевого счетчика Victor5. Активность трипсина измеряли с использованием флуорогенного анализа с субстратом, специфичным для трипсина (Boc-Glu-Ala-Arg-AMC) (MQR-3135-v, Peptides International, Луисвилл, Кентукки, США).Активность химотрипсина измеряли с использованием флуорогенного анализа с субстратом, специфичным для химотрипсина (Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-MCA) (MAA-3114-v, Peptides International).

4.11. Анализ ПЦР в реальном времени на IL-6

Клетки (2,0 × 10 ⁵ клеток / 2 мл / лунка) обрабатывали ликопином в 6-луночных планшетах в течение 4 часов. Тотальную РНК выделяли с использованием реагента TRI® (Molecular Research Center, Inc., Цинциннати, Огайо, США). Суммарная РНК была преобразована в кДНК путем обратной транскрипции со случайным гексамером и обратной транскриптазой MuLV (Promega, Мэдисон, Висконсин, США) и нагреванием при 23 ° C в течение 10 минут, 37 ° C в течение 60 минут и 95 ° C в течение 5 минут. .КДНК использовали для ПЦР в реальном времени со специфическими праймерами для IL-6 и β-актина. Последовательности праймеров IL-6, используемых для получения желаемых продуктов ПЦР 590 п.н., были 5′-GAGAGGAGACTTCACAGAGGATACCA-3 ‘(прямой праймер) и 5′-CCACAGTGAGGAATGTCCACAA-3′ (обратный праймер). Для продукции кДНК β-актина был получен продукт ПЦР длиной 349 пар оснований с использованием прямого праймера 5’-ACCAACTGGGACGACATGGAG-3 ‘и обратного праймера 5′-GTGAGGATCTTCATGAGGTAGTC-3’. Для ПЦР-амплификации кДНК амплифицировали с помощью 35 повторных циклов денатурации при 95 ° C в течение 30 секунд, отжига при 53 ° C в течение 30 секунд и удлинения при 72 ° C в течение 45 секунд.Во время первого цикла шаг 95 ° C был увеличен до 3 мин. Ген β-актина амплифицировали в той же реакции, чтобы он служил эталонным геном.

4.12. Иммуноферментный анализ (ELISA) для IL-6

Клетки (2,0 × 10 ⁵ клеток / 2 мл / лунка) в 6-луночных планшетах) обрабатывали ликопином в течение 24 часов. Концентрацию IL-6 в среде определяли с использованием наборов для твердофазного иммуноферментного анализа (R&D Systems, Миннеаполис, Миннесота, США) в соответствии с инструкциями производителя.

4.13. Статистический анализ

Для статистического анализа использовали односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) с последующим апостериорным критерием Ньюмана-Кеуля. Все данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка (SE) трех различных экспериментов. Для каждого эксперимента количество образцов в каждой группе составляло 4 (n = 4 в каждой группе). Статистически значимым считалось значение p 0,05.

Мезенхимальные стволовые клетки костного мозга (BMSC) восстанавливают острый некротизированный панкреатит путем секреции микроРНК-9 для нацеливания на ген NF-κB1 / p50 у крыс

Материалы и реагенты

Ficoll-Paque Premium ( Ficoll, плотность = 1.077 г / мл ) был приобретен в GE Healthcare Life Sciences ( Piscataway, NJ, USA ), 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндол ( DAPI ), полибрен, диметилсульфоксид ( DMSO ), 3 – (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2, S-дифенилтетразолий бромид ( MTT ), Na-таурохолат (NaT) , поли-L-лизин, нитроцеллюлозная мембрана, ингибитор трипсина сои, трипановый синий и вторичные антитела были приобретены у Sigma-Aldrich ( Brooklyn, NY, USA ).Наборы для анализа активности амилазы и липазы были от Biovision ( Пало-Альто, Калифорния, США ), SPION ( Fe ). ₂ O ₃ , 30 нм ) были получены от Dk Nanotechnology Company ( Beijing, China ), TRIzol, TRIzol LS Reagent, Lipofectamine 2000 ( Lipo2000 ), лизис красных кровяных телец, пенициллин, стрептомицин, стрептомицин, CM-Dil и Histostain-Plus Набор ( DAB, широкий спектр ) был от Invitrogen ( Карлсбад, Калифорния, США ), Dulbecco’s Modified Eagle’s Eagle’s Medium-High / Low Glory ( DMEM-H / LG ), среда Roswell Park Memorial Institute 1640 ( RMPI) -1640 ), 0.25% трипсин-ЭДТА и фетальная бычья сыворотка ( FBS ) были от Gibico ( Миддлтон, Висконсин, США, ), буфер для лизиса RIPA, набор для анализа концентрации белка BCA, фенилметансульфонилфторид ( PMSF, 100 ). мМ ), репортерный вектор pGL6-TA-luc и набор для окрашивания берлинской синей были получены от Beyotime Biotechnology ( Наньтун, провинция Цзянсу, Китай ), агароза была от компании Biowest (Испания), антитела, направленные против CD68, TNF-α, TGF-β, IL-1β и миелопероксидаза ( MPO ) были от Abcam ( Кембридж, Массачусетс, США ), глицеральдегид-фосфатдегидрогеназа ( GAPDH ) от ProteinTech ( Ухань, провинция Хубэй, Китай ) -P65, NF-κB1 / P50, IκBα и IκBβ от CST ( Danvers, MA, USA ), панкреатический и двенадцатиперстный гомеобокс 1 ( PDX1 ) и специфический для поджелудочной железы фактор транскрипции 1 ( PTF1 ) от Santa Cruz Biotechnology ( Santa Cruz, CA, USA ), Регенерирующий белок 4 островкового происхождения ( Reg4 ) от Bioworld Technology ( St.Louis, MN, USA ), наборы для иммуноферментного анализа IL-1β, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-α и TGF-β ( ELISA ) были приобретены в R&D Systems ( Minneapolis , MN, USA ), белок (HMGB1) ELASA группы High-Mobility Group Box 1 от Uscn Life Science Inc ( Ухань, провинция Хубэй, Китай ), эндонуклеаза рестрикции, компетентная Escherichia coli ( DH5α ) , Фермент Taq, набор реагентов для обратной транскриптазы PrimeScript и ДНК-полимераза Primer STAR Max, набор MutanBEST и полинуклеотидкиназа Т4 были получены от Takara Biotechnology (, Далянь, провинция Ляонин, Китай, ), набор для очистки ДНК, система анализа двойных люциферазных репортеров и pRL-TK вектор были от корпорации Promega (Пекин, Китай, ), мини-плазмидный набор TIANprep и набор для очистки TIANgel Midi Purification Kit были от компании Tiangen Biotechnology (Пекин, Китай, ).

Клетки и культура клеток

Мезенхимальные стволовые клетки костного мозга ( BMSC ), выделенные у крыс Sprague-Dawley (SD) в течение 3-4 недель, культивировали в полной среде DMEM-LG, как описано ранее ²⁵ . Клетки HEK-293T ( клетки эмбриональной почки человека-293, экспрессирующие большой Т-антиген обезьяньего вируса 40 ) были приобретены из банка клеток Китайской академии наук и культивированы в среде DMEM-HG с добавлением 10% FBS, 100 Ед. / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина.Клетки переваривали и пассировали в соотношении 1: 5 при достижении 80% слияния. Мононуклеарные клетки периферической крови ( PBMC, ) очищали центрифугированием в градиенте плотности от здоровых крыс, как описано ранее ⁵⁶ . Вкратце, 5 мл периферической крови собирали в пробирку с антикоагулянтом и разбавляли 5 мл физиологического раствора с фосфатным буфером ( PBS, ). Затем к указанной выше смеси медленно добавляли 5 мл Ficoll и центрифугировали при 2500 об / мин в течение 20 минут при комнатной температуре.Наконец, собирали белую похожую на туман жидкость среднего слоя (PBMC), трижды промывали PBS, ресуспендировали в среде RPMI-1640 с добавлением 10% FBS, 100 Ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина. и культивировали в увлажненном инкубаторе с 5% CO ₂ при 37 ° C.

miRNAs Targeting Prediction

Прогнозирование miRNAs Targeting Prediction было выполнено с помощью алгоритмов TargetScan ⁵⁷ , PicTar ⁵⁷ , microRNA org ⁵⁸ и miRWalk Targets ⁵⁹ .Результаты были пересечены MatchMiner ⁶⁰ , предполагая, что ген NF-κB1 / p50 был потенциальным геном-мишенью для miR-9.

Общая ПЦР (gPCR) и количественная ПЦР в реальном времени (qRT-PCR)

Общую РНК экстрагировали с помощью TRIzol или TRIzol LS Reagent из клеток, замороженных образцов поджелудочной железы или сыворотки. КДНК первой цепи синтезировали с помощью набора реагентов для обратной транскриптазы PrimeScript ^TM Reverse Transcriptase Reagent Kit. Заинтересованные гены амплифицировали с помощью общей ПЦР (gPCR) с использованием фермента Taq в соответствии с инструкциями производителя: 98 ° C 10 с, 53 ° C 30 с, 72 ° C 30 с, 30 циклов и гель агарозы сканировали с помощью Gel Doc ™. XR + Imager ( Bio-Rad, CA, USA ).Уровни мРНК определяли с помощью qRT-PCR с использованием набора KAPA Kit ( Kapa Biosystems, Boston, USA ) и системы Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR (Thermo Fisher Scientific, Калифорния, США) , как описано ранее ²⁶ . Праймеры были синтезированы Пекинским институтом геномики (, Пекин, Китай, ). GAPDH и U6 были взяты в качестве эндогенного контроля. Последовательности праймеров перечислены в Таблице 1. Наконец, значения порога четырехповторного цикла ( CT ) были проанализированы с помощью программного обеспечения SDS ( Applied Biosystems, CA, USA ), а уровни целевых генов мРНК были количественно определены сравнительным CT. метод.Процедуру повторяли более трех раз. Каждому измерению было задано три повтора.

Иммуноблоттинг и иммуногистохимия

Процедура иммуноблоттинга была описана в нашем предыдущем исследовании ²⁶ . Вкратце, все белки экстрагировали с помощью буфера для лизиса RIPA с добавлением PMSF ( 1: 100 ) и коктейльных таблеток с ингибитором протеазы ( Roche Applied Science, Шанхай, Китай, ) и количественно оценивали методом BCA.Затем белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану и инкубировали с первичными и вторичными антителами. Наконец, нитроцеллюлозную мембрану детектировали с помощью аналитического программного обеспечения Odyssey 3.0 ( LI-COR Biotechnology, Небраска, США, ). Эксперимент повторяли более трех раз. Кроме того, иммуногистохимия была также представлена ​​в этом исследовании для измерения экспрессионных уровней воспалительных сигнальных белков, процедура которых была описана в нашем предыдущем исследовании ²⁶ .

Конструирование векторов miR-9 и анти-miR-9

Геномную ДНК крысы получали с помощью набора для очистки ДНК в соответствии с инструкциями производителя. Фрагмент ДНК длиной 368 п.н., содержащий последовательность miR-9-1 ( NC_005101.4 ), амплифицировали из геномной ДНК с помощью ДНК-полимеразы Primer STAR Max ( 98 ). ° С 10 с, 53 ° С 5 с, 72 ° С 5 с, 30 циклов) с использованием следующих праймеров: смысловой, 5 ‘ -GACAGCTAGCTCTCGTCGTGCTAGTGCGTG-3 ‘ и антисмысловой, 5 ‘ -GTCAGGATCCTGGCTGAGCTGAGCAACCCT-3.Затем амплифицированный фрагмент и вектор PCDH-CMV-MSCs-EF1-GFP-T2A-Puro (PCDH) ( System Biosciences, CA, USA ) переваривали ферментами Nhe I и BamH I для получения липких концов, соответственно, и соединяли ДНК-лигазой Т4 при 16 ° C в течение ночи для создания рекомбинантной плазмиды ( pri-miR-9-PCDH ). Наконец, рекомбинантную плазмиду трансформировали в DH5α для репликации в течение 16 часов (ч), экстрагировали с помощью набора TIANprep Mini Plasmid Kit и идентифицировали с помощью gPCR, двойного ферментативного расщепления и анализа секвенирования ( Beijing Genomics Institute, Beijing, China ).Кроме того, мы сконструировали плазмиду анти-miR-9, применив технику жесткой ловушки РНК ( TuD ), как описано ранее ⁶¹ . Вкратце, ложная последовательность анти-miR-9 была сконструирована следующим образом: 5 ‘ -TCATACAGCTAG ATCT ATAACCAAAGA-3 ′ и 5 ′ -TCTTTGGTTAT АГАТ CTAGCTGTATGA-3 ‘и синтезирован Пекинским институтом геномики.Затем указанные выше пары олигонуклеотидов и вектор PLKO.1 ( System Biosciences, CA, USA ) переваривали ферментами Age I и EcoR I и связывали в течение ночи с использованием ДНК-лигазы Т4 для получения рекомбинантной плазмиды PLKO.1-TuD. Наконец, рекомбинантную плазмиду переносили в DH5α для репликации, экстрагировали с помощью набора TIANprep Mini Plasmid Kit и проверяли анализом последовательности.

BMSC были инфицированы лентивирусом

Рекомбинантный лентивирус, кодирующий miR-9 или TuD, был получен системой упаковки лентивирусов ( System Biosciences, CA, USA ) в соответствии с инструкциями производителя.Во-первых, векторы pri-miR-9-PCDH, PLKO.1-TuD или PCDH ( 8 мкг / пластина ), pCMVΔ R8.74 , экспрессирующая gag / pol ВИЧ, Rev и tat ( 5,3 мкг / планшет ) и pMD2.G, экспрессирующий VSV-G ( 2,65 мкг / планшет ) котрансфицировали в клетки HEK293T с помощью Lipo2000, как описано ранее ⁶² . Во-вторых, супернатанты собирали через 24 и 48 часов соответственно и концентрировали с помощью раствора для преципитации вируса PEG-it ( System Biosciences, CA, USA ) или суперцентрифугированием ( 75000 ). × г, 2 часа ).В-третьих, вирусные шины измеряли, как описано ранее ⁶³ , и BMSC были инфицированы pri-miR-9-, empty- и TuD-лентивирусом с множественностью инфекции (MOI) 50 при помощи полибрена ( 8 ). мкг / мл ) для конструирования клеточных линий pri-miR-9-BMSC, пустых вирусов-BMSC и TuD-BMSC. Наконец, мРНК были обработаны, и экспрессия miR-9 была обнаружена с помощью gPCR и qRT-PCR. Все вирусные эксперименты проводились в боксе биологической безопасности.

Трансфекция миметиками Cy3-miR-9a-5p и обнаружение активности NF-κB

Пустые вирусные BMSC, стабильно экспрессирующие GFP, трансфицировали с помощью Lipo2000 миметиками Cy3-miR-9a-5p (50 нМ) или miR-9a- 5p контроль (50 нМ), как описано ранее ⁶⁴ . Через 24 часа их совместно культивировали с PBMC, стимулированными LPS (5 мкг / мл) в течение 24 часов. Наконец, мРНК и белки экстрагировали реагентом TRIzol и буфером для лизиса RIPA через 48 и 72 часа соответственно. Выражение miR-9 измеряли с помощью qRT-PCR и gPCR.Между тем, экспрессия NF-κB1 / p50 определялась вестерн-блоттингом и qRT-PCR, а активность NF-κB анализировалась с помощью системы двойного анализа люциферазных репортеров (Promega). Плазмида pGL6-TA-luc была выбрана в качестве матрицы для конструирования репортерного вектора NF-κB-luc, содержащего ответный элемент NF-κB: 5 ‘ -GGGAATTTCCGGGAATTTCCGGGAATTTCCGGGAATTTCC-3 ‘. PBMC сначала культивировали совместно с BMSC трансфекции miR-9a-5p в течение 24 часов, а затем котрансфицировали Lipo2000 репортерным вектором NF-κB-Luc ( 0.1 мкг ) и люциферазы Renilla ( pRL-TK, 0,1 мкг) . Через 6 часов PBMC моделировали с помощью LPS в течение 48 часов в концентрации 5 мкг / мл и собирали с помощью буфера для пассивного лизиса (Promega, Пекин, Китай) . Люциферазную активность NF-κB измеряли и оценивали с помощью двойной системы анализа репортерной люциферазы. Эксперименты повторялись более трех раз.

Животные модели

Самцы крыс SD массой 200–250 г ( n = 100 ) были приобретены у Shanghai Laboratory Animal Co.Ltd (, Шанхай, Китай, ), кормили в подходящей среде с температурой 25 ° C и 12-часовым циклом темнота / свет и имели свободный доступ к воде и пище. Модели AP индуцировали трехкратной инъекцией в брюшину Caerulein ( 100 мкг / кг, ) или ретроградной инъекцией 3% NaT ( 1 ). мл / кг ), как описано ранее ^{21, 26, 65} . Все процедуры соответствуют Постановлению о лабораторных животных Шанхая и одобрены Управлением по этике Шанхайской десятой народной больницы при университете Тунцзи (, Шанхай, Китай, ).

Трансплантация клеток, группирование животных и подготовка образцов

Крысам случайным образом вводили в хвостовую вену pri-miR-9-BMSC, пустые вирусы-BMSC, TuD-BMSC или BMSC (1 × 10 ⁷ клеток / кг ) на 1-й день после операции, как описано ранее ²⁶ и, таким образом, разделены на NC ( n = 6 ), имитация ( n = 6 ), SAP ( n = 6 ), SAP + PBS (обработка PBS) ( n = 6 ), BMSC ( n = 6 ), pri-miR-9-BMSC ( n = 6 ), пустые вирусные BMSC ( n = 6 ), TuD-BMSC ( n = 6 ).Кроме того, чтобы выявить взаимосвязь между miR-9 и AP, мы установили несколько моделей AP следующим образом: NC ( n = 3 ), Sham ( n = 3 ), Caerulein ( n = 3 ), 3% NaT ( n = 3 ). Более того, чтобы продемонстрировать, что miR-9 может снижать SAP, мы вводили агомир miR-9a-5p ( 1 мкМ ) и контроль miR-9a-5p ( 1 мкМ ) (Biotend Company, Шанхай, Китай) крысам SAP через хвостовую вену в соответствии с инструкциями производителя (http: // www.biotend.com/miRNA). Затем этих крыс убивали человеком на 3-й день после обработки или на 4-й послеоперационный день. Наконец, сыворотку собирали центрифугированием 8000 × g при 4 ° C в течение 20 минут и хранили при -80 ° C. Ткани получали с помощью хирургических транспортных средств и хранили в жидком азоте или при -80 ° C или фиксировали в 4% параформальдегиде.

Двойные репортерные анализы люциферазы

Фрагмент 3’UTR NF-κB1 (319 п. клонировали в вектор psiCHECK-2 ( Promega, Пекин, США, ) для получения рекомбинантной плазмиды psiCHECK-2-NF-κB1 3’UTR (wtUTR) , которая была идентифицирована с помощью анализа последовательности.Кроме того, фрагмент 3′UTR NF-κB1 (319 п.н. ), содержащий мутацию пяти оснований ( CAAAG → TGCGA ), амплифицировали с помощью набора TaKaRa MutanBEST Kit с применением следующих праймеров: 5 ‘- GAAGCGGCCGCCGTTCCCACACTGTAAAC TGCGA CCCTGAAAGGCC-3 ‘и 5’- GCCACTCGAGCCTTAATGACAGCGGGGAC -3′ и клонированы в вектор psiCHECK-2 на сайтах XhoI и Not I для создания рекомбинантной плазмиды 3’UTR NF-κB1, мутационная плазмида UTR (мутация ) был идентифицирован анализом последовательности.Плазмида wtUTR ( 1 мкг ) или mutUTR ( 1 мкг ) и миметики miR-9a-5p ( 50 нМ ) котрансфицировали в клетки HEK293T с помощью Lipo2000. Наконец, активность люциферазы светлячков измеряли с помощью двойной системы анализа репортеров люциферазы через 48 часов после трансфекции. Эксперименты повторяли более трех раз.

Окрашивание гематоксилином-эозином (H&E)

Окрашивание H&E залитых парафином тканей поджелудочной железы проводили для исследования тяжести ОП, как описано ранее. ²⁵ .

ELISA и анализы активности амилазы, липазы и MPO

Уровни сывороточного IL-1β, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-α, TGF-β и HBMG1 определялись с помощью набора для ELISA, как описано ранее ²⁶ . Активность сывороточной амилазы и липазы измеряли с помощью набора для анализа амилазы и липазы, как описано ранее ²⁵ .Активность МПО в тканях поджелудочной железы определяли с помощью набора для обнаружения МПО ( Jiancheng Bioengineering, Нанкин, провинция Цзянсу, Китай, ), как описано ранее ⁶⁶ .

TUNEL

Окрашивание с меткой ник-конца терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы dUTP (TUNEL) использовали для обнаружения клеточного апоптоза поврежденных тканей поджелудочной железы с помощью набора One Step TUNEL Apoptosis Assay Kit ( Beyotime Biotechnology, Nantong, ). следуя руководству производителя, как описано ранее ⁶⁷ .Апоптозные клетки наблюдали как частицы зеленой флуоресценции и подсчитывали в случайно выбранных пяти полях при × 200.

CM-Dil- / SPION-меченные BMSC и