МБОУ СОШ № 56 ГОРОДА КИРОВА, ИНН 4347028017
Основание внесения оператора в реестр (номер приказа): 19
Адрес местонахождения оператора: 610016, Кировская обл., г. Киров, пр-кт Октябрьский, д. 21
Дата начала обработки персональных данных: 01.09.1964
Субъекты РФ, на территории которых происходит обработка персональных данных: Кировская область
Цель обработки персональных данных: Для работников – получение информации, необходимой работодателю в связи с трудовыми отношениями и касающейся конкретного работника. Для обучающихся – получение информации, необходимой образовательному учреждению в связи с отношениями, возникающими между обучающимися, его родителями (законными представителями) и образовательным учреждением.
Описание мер, предусмотренных ст. 18.1 и 19 Закона: 1) Назначение ответственного за организацию обработки персональных данных, 2) Разработка Положения о работе с персональными данными работников и обучающимися в МБОУ СОШ № 56 города Кирова, 3) Обработка персональных данных осуществляется на основе следующих принципов: соответствие целей обработки персональных данных целям, заранее определенным и заявленным при смене персональным данным, соответствие объема и характера обрабатываемых персональных данных, достоверность персональных данных, их достаточность для целей обработки, недопустимость объединения созданных для несовместимых между собой целей баз данных информационных систем персональных данных.
Категории персональных данных: фамилия, имя, отчество,год рождения,месяц рождения,дата рождения,место рождения,адрес,семейное положение,социальное положение,образование,профессия,национальная принадлежность,состояние здоровья, Сведения документах (паспорт, СНИЛС, ИНН), документы об образовании, курсовой подготовке, трудовом стаже, аттестации, данные свидетельства о рождении, полис медицинского страхования, сведения об успеваемости, группа здоровья, физкультурная группа, сведения о родителях (законных представителях) (ФИО, телефон, образование, должность, место работы).
Категории субъектов, персональные данные которых обрабатываются: Работники МБОУ СОШ № 56 города Кирова, обучающиеся МБОУ СОШ № 56 города Кирова.
Перечень действий с персональными данными: Сбор, систематизация, накопление, хранение, обновление, изменение, использование.
Обработка персональных данных: смешанная,с передачей по внутренней сети юридического лица,без передачи по сети Интернет
Правовое основание обработки персональных данных: Федеральный закон от 2707.
2006 № 152-ФЗ “О персональных данных”, Федеральный закон от 27.07.2006 № 149 “Об информации, информационных технологиях и о защите информации”, Положение о работе с персональными данными работников и обучающихся в МБОУ СОШ № 56 города Кирова.
Сведения о местонахождении базы данных: Россия
| Contract number: 3434702801721000005 Subject: Выполнение работ по замене оконных блоков Conclusion date: 2021-06-02Execution completion date: 2021-12-13 | 229 500 |
| Contract number: 3434702801721000004 Subjects: Бумага для офисной техники белая and 1 more Conclusion date: 2021-04-30Execution completion date: 2021-06-18 | 74 276 |
| Contract number: 3434702801721000003 Supplier: АКЦИОНЕРНОЕ ОБЩЕСТВО “КИРОВСКАЯ ТЕПЛОСНАБЖАЮЩАЯ КОМПАНИЯ” Execution completion date: 2021-12-31 | 60 747 |
| Contract number: 3434702801721000002 Supplier: АКЦИОНЕРНОЕ ОБЩЕСТВО “КИРОВСКАЯ ТЕПЛОСНАБЖАЮЩАЯ КОМПАНИЯ” Subjects: Услуги по отоплению and 1 more Conclusion date: 2021-01-29Execution completion date: 2021-12-31 | 1 326 640 |
| Contract number: 3434702801721000001 Supplier: АКЦИОНЕРНОЕ ОБЩЕСТВО “ЭНЕРГОСБЫТ ПЛЮС” Subjects: поставка электроэнергии and 3 more Conclusion date: 2021-01-22Execution completion date: 2021-12-31 | 854 305 |
| Contract number: 3434702801720000006 Supplier: АКЦИОНЕРНОЕ ОБЩЕСТВО “КИРОВСКАЯ ТЕПЛОСНАБЖАЮЩАЯ КОМПАНИЯ” Subjects: Горячее водоснабжение and 1 more Execution completion date: 2020-12-31 | 17 956 |
| Contract number: 3434702801720000005 Supplier: ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ “УЧКНИГА” Subjects: Учебники печатные общеобразовательного назначения and 55 more Conclusion date: 2020-07-23Execution completion date: 2020-09-11 | 490 718 |
| Contract number: 3434702801720000004 Supplier: ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ ТД “ОКОННЫЙ СУПЕРМАРКЕТ” Subject: Выполнение работ по замене оконных блоков Execution completion date: 2020-12-21 | 239 759 |
| Contract number: 3434702801720000003 Supplier: ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ “ОФИС И СТИЛЬ” Subjects: Бумага для офисной техники белая and 1 more Conclusion date: 2020-04-20Execution completion date: 2020-06-01 | 83 041 |
| Contract number: 3434702801720000002 Supplier: АКЦИОНЕРНОЕ ОБЩЕСТВО “ЭНЕРГОСБЫТ ПЛЮС” Subjects: Услуги по торговле электроэнергией and 3 more Conclusion date: 2020-01-29Execution completion date: 2020-12-31 | 832 520 |
| Contract number: 3434702801720000001 Supplier: АКЦИОНЕРНОЕ ОБЩЕСТВО “КИРОВСКАЯ ТЕПЛОСНАБЖАЮЩАЯ КОМПАНИЯ” Subjects: Энергия тепловая, отпущенная тепловыми электроцентралями (ТЭЦ) and 1 more Conclusion date: 2020-01-14Execution completion date: 2020-12-31 | 1 364 555 |
| Contract number: 3434702801719000003 Supplier: ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ “АБРИС ВЯТКА” Subjects: Учебники печатные общеобразовательного назначения and 38 more Conclusion date: 2019-08-05Execution completion date: 2019-09-18 | 450 724 |
| Contract number: 3434702801719000002 Supplier: ОТКРЫТОЕ АКЦИОНЕРНОЕ ОБЩЕСТВО “ЭНЕРГОСБЫТ ПЛЮС” Subjects: поставка электрической энергии and 3 more Conclusion date: 2019-01-23Execution completion date: 2019-12-31 | 947 626 |
| Contract number: 3434702801719000001 Supplier: АКЦИОНЕРНОЕ ОБЩЕСТВО “КИРОВСКАЯ ТЕПЛОСНАБЖАЮЩАЯ КОМПАНИЯ” Subjects: Энергия тепловая, отпущенная тепловыми электроцентралями (ТЭЦ) and 1 more Conclusion date: 2019-01-10Execution completion date: 2019-12-31 | 1 396 446 |
| Contract number: 3434702801718000003 Supplier: ОТКРЫТОЕ АКЦИОНЕРНОЕ ОБЩЕСТВО “ЭНЕРГОСБЫТ ПЛЮС” Subject: Услуги по передаче электроэнергии Conclusion date: 2018-11-27Execution completion date: 2019-05-31 | 189 839 |
| Contract number: 3434702801718000002 Supplier: ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ “КОМПАНИЯ НАХОДКА” Subject: Проектор Epson EB-X05 Conclusion date: 2018-04-02Execution completion date: 2018-05-16 | 205 464 |
| Contract number: 3434702801718000001 Supplier: ОТКРЫТОЕ АКЦИОНЕРНОЕ ОБЩЕСТВО “ЭНЕРГОСБЫТ ПЛЮС” Subjects: Услуги по передаче электроэнергии and 1 more Conclusion date: 2018-01-12Execution completion date: 2018-12-31 | 917 480 |
| Contract number: 3434702801717000005 Supplier: АКЦИОНЕРНОЕ ОБЩЕСТВО “КИРОВСКАЯ ТЕПЛОСНАБЖАЮЩАЯ КОМПАНИЯ” Subjects: Энергия тепловая, отпущенная тепловыми электроцентралями (ТЭЦ) and 2 more Conclusion date: 2017-12-19Execution completion date: 2018-12-31 | 1 273 322 |
| Contract number: 3434702801717000004 Supplier: Физическое лицо: Сергеев Александр Владимирович Subject: выполнение работ по текущему ремонту системы отопления Conclusion date: 2017-06-20Execution completion date: 2017-08-19 | 265 950 |
| Contract number: 3434702801717000003 Supplier: ООО ‘ТСО’ Subject: выполнение работ по замене автоматической пожарной сигнализации и системы оповещения и управления эвакуацией людей при пожаре. Execution completion date: 2017-08-19 | 773 800 |
| Contract number: 3434702801717000002 Supplier: ОТКРЫТОЕ АКЦИОНЕРНОЕ ОБЩЕСТВО “КИРОВСКАЯ ТЕПЛОСНАБЖАЮЩАЯ КОМПАНИЯ” Subject: оказание услуг по снабжению паром в горячей воде Conclusion date: 2017-02-28Execution completion date: 2018-06-30 | 1 419 533 |
| Contract number: 3434702801717000001 Supplier: ОТКРЫТОЕ АКЦИОНЕРНОЕ ОБЩЕСТВО “ЭНЕРГОСБЫТ ПЛЮС” Subject: Услуги по передаче электроэнергии Conclusion date: 2017-01-01Execution completion date: 2018-06-30 | 954 389 |
| Contract number: 3434702801716000004 Supplier: ОТКРЫТОЕ АКЦИОНЕРНОЕ ОБЩЕСТВО “ЭНЕРГОСБЫТ ПЛЮС” Subject: Электрическая энергия Conclusion date: 2016-06-30Execution completion date: 2017-05-30 | 679 857 |
| Contract number: 3434702801716000003 Supplier: Физическое лицо: ИП Шамов Сергей Петрович Subjects: Русский язык. Execution completion date: 2016-07-28 | 158 957 |
| Contract number: 3434702801716000001 Supplier: ОТКРЫТОЕ АКЦИОНЕРНОЕ ОБЩЕСТВО “КИРОВСКАЯ ТЕПЛОСНАБЖАЮЩАЯ КОМПАНИЯ” Subjects: Тепловая энергия and 1 more Conclusion date: 2016-01-03Execution completion date: 2016-12-31 | 1 549 017 |
7 класс. Баранов М.Т., Ладыженская Т.А., Тростенцова Л.А. и др.
and 30 moreКак доехать до школа 56 в Октябрьский Район на автобусе или троллейбусе
Общественный транспорт до школа 56 в Октябрьский Район
Не знаете, как доехать до школа 56 в Октябрьский Район, Россия? Moovit поможет вам найти лучший способ добраться до школа 56 от ближайшей остановки общественного транспорта, используя пошаговые инструкции.
Moovit предлагает бесплатные карты и навигацию в режиме реального времени, чтобы помочь вам сориентироваться в городе. Открывайте расписания, поездки, часы работы, и узнайте, сколько займет дорога до школа 56 с учетом данных Реального Времени.
Ищете остановку или станцию около школа 56? Проверьте список ближайших остановок к пункту назначения: Гостиница “Спутник”; Офтальмологическая Больница; Ул. Чернышевского; Площадь Имени Лепсе.
Вы можете доехать до школа 56 на автобусе или троллейбусе. У этих линий и маршрутов есть остановки поблизости: (Автобус) 54, 70, 90 (Троллейбус) 1
Хотите проверить, нет ли другого пути, который поможет вам добраться быстрее? Moovit помогает найти альтернативные варианты маршрутов и времени.
Получите инструкции, как легко доехать до или от школа 56 с помощью приложения или сайте Moovit.
С нами добраться до школа 56 проще простого, именно поэтому более 930 млн. пользователей доверяют Moovit как лучшему транспортному приложению. Включая жителей Октябрьский Район! Не нужно устанавливать отдельное приложение для автобуса и отдельное приложение для метро, Moovit — ваше универсальное транспортное приложение, которое поможет вам найти самые обновленные расписания автобусов и метро.
МБОУ СОШ №56 ГОРОДА КИРОВА – Киров – Директор
В базе данных ФГИС ЕРП Генеральной Прокуратуры РФ найдено 9 проверок в отношении МБОУ СОШ №56 ГОРОДА КИРОВА
| С нарушениями | Без нарушений | Нет данных о результатах | |||
| 4 | 44.44% | 5 | 55.56% | 0 | 0% |
Последняя проверка
№ 431903040548 от 10 сентября 2019 годаВнеплановая документарная проверка
Орган контроля (надзора) из ФРГУ?
Цель проверки
Контроля исполнения МБОУ СОШ № 56 города Кирова пункта 2 ранее выданного предписания об устранении выявленных нарушений санитарных правил № 0052 от 27.
04.2017. задачами настоящей проверки являются: надзор и контроль за исполнением обязательных требований законодательства Российской Федерации в области обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения, предупреждение вредного воздействия на человека факторов среды обитания, профилактика инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний (отравлений) населения. 7. Предметом настоящей проверки является выполнение предписаний органов государственного контроля (надзора)
Выявлены нарушения
Согласно данным ЕГРЮЛ, организация МБОУ СОШ №56 ГОРОДА КИРОВА — или МУНИЦИПАЛЬНОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБЩЕОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ “СРЕДНЯЯ ОБЩЕОБРАЗОВАТЕЛЬНАЯ ШКОЛА №56” ГОРОДА КИРОВА — зарегистрирована 3 марта 1997 года по адресу 610016, Кировская область, г. Киров, пр-т Октябрьский, д. 21. Налоговый орган — межрайонная инспекция Федеральной налоговой службы №14 по Кировской области.
Реквизиты юридического лица — ОГРН 1034316514430, ИНН 4347028017, КПП 434501001.
Регистрационный номер в ПФР — 053002009255, регистрационный номер в ФСС — 434503538143001. Организационно-правовой формой является “Муниципальные бюджетные учреждения”.
Основным видом деятельности МБОУ СОШ №56 ГОРОДА КИРОВА является “Образование среднее общее”. Организация также зарегистрирована в таких категориях ОКВЭД как “Образование дополнительное детей и взрослых”, “Образование начальное общее”, “Образование основное общее”, “Деятельность физкультурно- оздоровительная”.
Директор — Пушкарева Елена Александровна.
На 19 июня 2021 года юридическое лицо является действующим.
МБОУ “СОШ №56 ИМ. П.П. БАЛЮКА” ГОРОДА ГРОЗНОГО – Грозный
Реквизиты
| ОГРН? | 1092031003140 от 10 августа 2009 года |
|---|---|
| ИНН? | 2014263532 |
| КПП? | 201401001 |
| Код КЛАДР? | 200000010000202 |
| Код СПЗ? | 03943000640 |
| ИКУ? | 32014263532201401001 |
Коды статистики
| Код ОКПО? | 61505783 |
|---|---|
| Код ОКОГУ? | 4210007 (Муниципальные организации) |
| Код ОКОПФ? | 75403 (Муниципальные бюджетные учреждения) |
| Код ОКФС? | 14 (Муниципальная собственность) |
| Код ОКАТО? | 96401364000 (Ленинский) |
| Код ОКТМО? | 96701000001 (г Грозный) |
Смотрите также сведения о регистрации организации
Проверки
Информация о проверках в отношении МБОУ “СОШ №56 ИМ.
П.П. БАЛЮКА” ГОРОДА ГРОЗНОГО на основании данных ФГИС “Единый Реестр Проверок” Генеральной Прокуратуры РФ
| С нарушениями | Без нарушений | Нет данных о результатах | |||
| 11 | 68.75% | 2 | 12.5% | 3 | 18.75% |
Последняя проверка
Подробная информация по всем проверкам (16)
Организация МБОУ “СОШ №56 ИМ. П.П. БАЛЮКА” ГОРОДА ГРОЗНОГО, г. Грозный, зарегистрирована 10 августа 2009 года, ей были присвоены ОГРН 1092031003140, ИНН 2014263532 и КПП 201401001, регистратор — Управление Федеральной налоговой службы по Чеченской Республике. Полное наименование — МУНИЦИПАЛЬНОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБЩЕОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ “СРЕДНЯЯ ОБЩЕОБРАЗОВАТЕЛЬНАЯ ШКОЛА №56 ИМ. П.П. БАЛЮКА” ГОРОДА ГРОЗНОГО. Юридический адрес организации — 364049, республика Чеченская, г. Грозный, пр-т Мохаммеда Али, д. 29. Основным видом деятельности является “Образование начальное общее”.
Организация “МБОУ “СОШ №56 ИМ. П.П. БАЛЮКА” ГОРОДА ГРОЗНОГО” также зарегистрирована в таких категориях ОКВЭД (всего 3) как “Образование дополнительное детей и взрослых”, “Образование основное общее”, “Образование среднее общее”. Директор — Ахъядова Роза Хасановна. Организационно-правовая форма (ОПФ) — муниципальные бюджетные учреждения. На сегодняшний день организация является действующей.
Смотрите также
| ГОРИЗОНТ ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ “ГОРИЗОНТ” 119334, г. Москва, 5-й Донской проезд, д. 21, корп. 1, пом. 21 комната 15 Деятельность рекламных агентств |
| МАДОУ ДЕТСКИЙ САД №27 МУНИЦИПАЛЬНОЕ АВТОНОМНОЕ ДОШКОЛЬНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ДЕТСКИЙ САД №27 “НАДЕЖДА” ГОРОДСКОГО ОКРУГА ГОРОД ОКТЯБРЬСКИЙ РЕСПУБЛИКИ БАШКОРТОСТАН 452613, республика Башкортостан, г. Октябрьский, микрорайон 35-й, д. 36 Образование дошкольное |
| СТТ ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ “СТТ” 127055, г.  Москва, ул. Сущёвская, д. 12, стр. 1, комната 9Торговля оптовая прочими бытовыми товарами |
| СНТ “РЯБИНА” САДОВОДЧЕСКОЕ НЕКОММЕРЧЕСКОЕ ТОВАРИЩЕСТВО “РЯБИНА” 601120, Владимирская область, Петушинский район, д. Киржач Управление эксплуатацией нежилого фонда за вознаграждение или на договорной основе |
| БЫСТРЫЙ СЕРВИС ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ “БЫСТРЫЙ СЕРВИС” 105094, г. Москва, ул. Большая Семёновская, д. 42/2-4, стр. 22 Техническое обслуживание и ремонт автотранспортных средств |
| НГФ ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ “НАЦИОНАЛЬНАЯ ГИЛЬДИЯ ФРИЛАНСЕРОВ” 109469, г. Москва, бульвар Мячковский, д. 31/19, этаж 1 пом. IV комната 9 Деятельность по обработке данных, предоставление услуг по размещению информации и связанная с этим деятельность |
| АНО ЦПОЖ “ЖЗБ” АВТОНОМНАЯ НЕКОММЕРЧЕСКАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ЦЕНТР ПОЖАРОБЕЗОПАСНОГО ОБРАЗА ЖИЗНИ “ЖЕНЩИНЫ ЗА БЕЗОПАСНОСТЬ” 127238, г.  Москва, Дмитровское шоссе, д. 46, корп. 2, комната 19Деятельность по обеспечению безопасности и проведению расследований |
Наша Радость – многопрофильный детский медицинский центр.
Наша Радость – многопрофильный детский медицинский центр.Акция
“Здоровое сердце”
В медцентре
“Наша радость”
новый ревматолог!
В медцентре “Наша радость” теперь можно записаться на приём к ревматологу Ратушной Наталье Андреевне.
Опыт работы в педиатрии – 10 лет.
Основное место работы – заведующая педиатрическим отделением в КОГБУЗ Кировский клинико-диагностический центр
Не отменяйте визит к доктору!
Специалисты медцентра «Наша радость» проводят онлайн-приемы
Школа будущих мам
Ответим на все Ваши вопросы!
Детский невролог
Индивидуальный подход в лечении каждого ребёнка. Лучшие врачи Кирова и области с большим опытом работы!
Педиатрия
Доверьте здоровье своего ребёнка лучшим врачам с огромным опытом! Патронаж, наблюдение, профилактика и лечение любых детских заболеваний.
Ортопед и травматолог
Приём детей от 0 до 18 лет. Точная диагностика и эффективное лечение проблем опорно-двигательного аппарата.
Ультразвуковая диагностика
Исследования любых органов и систем у детей. В нашем медицинском центре новейшее оборудование и лучшие опытные врачи.
Зондирование слезно-носового канала
Бережное лечение дакриоцистита новорожденных (непроходимости слезных каналов). Ведущие врачи-офтальмологи помогут вашему малышу!
«Наша радость» — это новый, современный многопрофильный детский медицинский центр, предлагающий широкий спектр лечебных и диагностических процедур для пациентов с рождения до 18 лет.
В нашем центре созданы все условия, чтобы пребывание в нём было комфортным для Вас и Вашего ребёнка: уютные помещения для ожидания приёмов, игровые зоны, удобные пеленальные столики, медицинское оборудование и инструменты, предназначенные для детей.
Главной ценностью МЦ «Наша радость» являются высококвалифицированные специалисты! Лучшие детские врачи области, современное оснащение и медицинское оборудование высокого качества позволяют осуществлять оперативную и точную диагностику заболеваний, назначать необходимое лечение.
Узнайте больше о нас → XОставить заявку на прием
Здесь вы можете оставить свои пожелания по дате и времени приема, специальности и/или фамилии доктора.
Обратите внимание,
что указанное вами точное время может быть занято. Наши администраторы примут онлайн-заявку и обязательно перезвонят вам
в течение суток для уточнения времени визита. Просьба срочную запись к специалистам (день в день) осуществлять по
телефонам 462-233, 222-135
МАУДО “Сыктывкарская детская музыкально-хоровая школа”
Дорогие участники конкурса “Ступени мастерства”! Мы рады поделиться с вами РЕЗУЛЬТАТАМИ КОНКУРСА. Более подробную информацию можно найти здесь.
От всей души поздравляем всех победителей!
– ВНИМАНИЕ!
Пофамильный список, принятых на обучение в 1 класс . Более подробно смотрите информацию во вкладке “Поступающим”. А также по ссылкам:
1 класс Народное
1 класс Оркестровое
1 класс Фортепиано
1 класс Хоровое
Организация учебного года 2020-2021 в МАУДО “Сыктывкарская детская музыкально-хоровая школа” в условиях распространения и профилактики новой коронавирусной инфекции (COVID-19)
***
Номер телефона «горячей линии»
для оказания консультационной поддержки всех участников образовательных отношений по вопросам организации образовательной деятельности в 2020-21 гг.
, всех организационных вопросов в условиях эпидемиологической ситуации по распространению новой коронавирусной инфекции:
тел. 8(8212) 24-14-56 (Ольга Владимировна)
***
© http://pozdravok.ru/pozdravleniya/prazdniki/noviy-god/10.htm
Рады Вас видеть на сайте Сыктывкарской детской музыкально-хоровой школы. Здесь Вы можете прочитать наши новости, узнать актуальную информацию для поступающих, посмотреть на достижения школы, заглянуть в афишу мероприятий и ознакомиться с перечнем конкурсов и конференций.
В настоящее время в стенах школы на фортепианном, оркестровом, вокально-хоровом, народном и общемузыкальном отделениях обучаются около 580 учащихся, примерно 238 ребятишек зачислены на отделение платных дополнительных образовательных услуг в подготовительные группы.
У нас осуществляется качественное обучение по специальностям: фортепиано, скрипка, виолончель, флейта, баян, аккордеон, гитара, домра, саксофон, синтезатор, хоровая капелла, сольное пение, хоровое пение, народное пение.
Каждый ученик окружен доброжелательной и дружеской атмосферой. Учебный процесс проходит под чутким надзором преподавателей с применением современных методов обучения.
Профессор Георгий Киров – Люди
Обзор
Исследования профессора Кирова сосредоточены на роли вариаций числа копий (CNV) и высокопроизводительном секвенировании при нервно-психических расстройствах. В своей клинической работе он руководит проведением ЭСТ в Кардиффе и дает второе мнение по поводу аффективных расстройств.
В настоящее время профессор Киров занимается анализом CNV у всех 500 000 участников Биобанка Великобритании. CNVs были названы и проанализированы их роль в заболевании и фенотипических различиях, и результаты были опубликованы.
Результаты также доступны на странице моего репозитория, где они при необходимости обновляются. Некоторые результаты можно проверить в интерактивном режиме: https://kirov.psycm.cf.ac.
uk/
Биография
Родился в Болгарии
1980-1986: Медицина в Медицинской академии в Софии
1989–1992: Обучение психиатрии в Великобритании, MRCPsych
.1996–1999: Стипендия по обучению Wellcome Trust, Кардифф
1999–2001: Программа Wellcome Advanced Fellowship, «Ассоциативные исследования маниакально-депрессивных заболеваний с использованием объединения ДНК».
августа 2002: доктор философии, Кардиффский университет: «Ассоциативные исследования маниакально-депрессивного заболевания с использованием объединения ДНК».
2001-2010: старший преподаватель кафедры психологической медицины и неврологии Кардиффского университета, Кардифф
2010-2014: доцент кафедры психологической медицины и неврологии Кардиффского университета
2014 – настоящее время: профессор кафедры психологической медицины и неврологии Кардиффского университета
Профессиональное членство
MRCPsych, MAcadMed, Общество WKL
Комитеты и проверки
Руководитель модуля: ME3085: «Научные основы психологической медицины» на промежуточной степени по психологии и медицине в Кардиффском университете
Директор клинической подготовки Центра MRC
Член комитета по этике университета
Руководитель учебного процесса
Обучение
Обучение и индивидуальное обучение студентов-медиков.
Организация ежегодной летней школы по исследованию заболеваний головного мозга.
куратор высших учебных заведений.
Руководитель модуля курса «Научные основы психиатрических расстройств» по модульной психологии в медицине с интеркалированной степенью в Кардиффском университете с 2015 года.
Экзаменатор со степенью магистра и последипломного образования в больнице Королевского колледжа Лондона (2003–2006 гг.) И Королевском университете в Белфасте (2019–23 гг.).
кандидатских экзаменов в качестве внешнего экзаменатора в Великобритании и за рубежом.
Набор: Я принимал участие в больших сборах выборок троек родитель-потомство из семей с маниакально-депрессивными и шизофреническими пробандами. В настоящее время это около 1120 семей. Я работаю над вариацией числа копий (CNV) при этих расстройствах, и у меня есть аспиранты, которые используют эти данные: Кимберли Кендалл и Мэтью Бракер-Смит. Это мой главный исследовательский интерес.
Несколько локусов получили поддержку благодаря моей работе над CNV, и эта работа продолжается с анализом возникающих de novo CNV и секвенированием, которым сейчас руководит Эллиотт Рис.
Исследование ЭСТ: это мое основное клиническое исследование. Я являюсь членом Комитета по ЭСТ Королевского колледжа. Предыдущие интересы включают литиевую терапию и ее влияние на щитовидную железу и почки.
Анализ последовательности экзома в 604 трио для рецессивных генотипов при шизофрении
Образцы
Образец трио родитель-пробанд шизофрении был описан ранее. 1, 6 Более подробная информация представлена в дополнительном материале (раздел 2).Вкратце, пробанды с шизофренией ( N = 534) или шизоаффективным расстройством ( N = 89) были набраны из психиатрических больниц в Болгарии. Все испытуемые посещали и окончили общеобразовательные школы, которые в то время в Болгарии исключали людей, имеющих значительную задержку в развитии или ID. Инструмент SCAN 20 использовался для проведения полуструктурированного интервью для выявления психозов и симптомов настроения, и два клинициста поставили согласованный диагноз в соответствии с критериями DSM-IV.623 пробанда, из которых 306 – мужчины, включают 597 троек (пробанд и родители), 12 четверных (двое пострадавших детей) и одну семью из нескольких поколений (пострадавшая дочь пострадавшей матери).
Последовательность и вызов вариантов
Подробности последовательности и вызова вариантов в болгарских трио были описаны ранее 1 и в дополнительном материале (раздел 3). Вкратце, парное секвенирование всего экзома на секвенаторах Illumina HiSeq было выполнено в трех центрах: Институте Броуда, Медицинской школе Икана на горе Синай и Институте Сэнгера Wellcome Trust.Все считывания неотмеченных последовательностей были сопоставлены с эталонным геномом человека (hg19), и варианты были вызваны в Институте Броуда с использованием конвейера BWA / Picard / GATK.
Описание нашего метода, используемого для вызова сложных гетерозиготных генотипов, можно найти в дополнительном материале (раздел 3, дополнительные рисунки S1 и S2).
Аннотации вариантов
Используя программное обеспечение ANNOVAR, 21 все варианты были аннотированы для их прогнозируемых функциональных последствий (например, синонимичные / несинонимичные) в соответствии с транскриптами RefSeq, на предмет перекрытия сегментной дупликации, их прогнозируемого влияния на функцию белка (Sift, 22 PolyPhen 2 (HumDiv) 23 и MutationTaster 24 ) и их частоту в проекте 1000 геномов (все комбинированные популяции, выпуск 2012 г.). 25 Кроме того, варианты были аннотированы по их частоте среди всех индивидуумов на сервере вариантов экзома (объединенные европейские и афроамериканские популяции, ESP6500, выпуск 26 ) и по их частоте среди болгарских родительских хромосом.
Фильтрация вариантов и контроль качества
Каждый вариантный сайт должен был пройти следующие фильтры во всех членах трио, где хотя бы один человек был носителем: глубина секвенирования ≥10; оценка качества генотипирования ≥30; баланс альтернативного аллеля ⩽0. 8 и ≥0.2 для гетерозиготных вызовов, ≥0.9 для гомозиготных вызовов нереференсного аллеля и ⩽0.1 для гомозиготных вызовов референсного аллеля. Пороги были выбраны эмпирически, чтобы гарантировать отсутствие значительного искажения передачи по всему экзому от нулевого ожидания (50:50) для вариантов с частотой минорных аллелей (MAF) ≤1% (глобальный тест неравновесия передачи, P = 0,07). , передаточное число: передаточное число = 0,99). Все варианты в сегментарных дупликациях были исключены, поскольку известно, что они обогащены артефактами секвенирования.Мы не включали индели, поскольку их назначение по-прежнему менее надежно, чем для точечных мутаций. Учитывая, что наше исследование было разработано для проверки генов редких патогенных рецессивных генотипов, мы исключили TTN и MUC16 из нашего анализа, поскольку эти гены имели большое количество редких (MAF ⩽ 1%) рецессивных генотипов нашей выборки ( n = 291 и 121 соответственно).
Пять троек были выбросами в отношении скорости передачи аллелей в масштабе экзома и были исключены из всех анализов (дополнительный материал, раздел 4 и дополнительный рисунок S4).
Мы также исключили еще трио, у которых в предыдущем исследовании было показано, что качество звонков низкое. 1 После удаления троек низкого качества и связанных пробандов, 604 пробанда из 604 семей были оставлены для анализа: из первоначальных 623 пробандов шесть были исключены по качеству и 13 были исключены по причине родства (один пробанд из 12 четверных и один пробанд. из многопоколенческой семьи).
Общий анализ обогащения
Чтобы проверить наличие избытка рецессивных генотипов у пробандов, мы использовали метод Lim et al. 8 Здесь нормализованный коэффициент обогащения был рассчитан как ( N генотипов у пробандов / N генотипов у родителей) × ( N родителей / N пробандов). Статистическая значимость глобального обогащения пробандов оценивалась с помощью одностороннего теста путем рандомизации статуса пробанд / родитель для 10 000 перестановок. Наши первичные анализы были выполнены с использованием порогового значения MAF ≤1%, поскольку более редкие аллели обогащены более опасными мутациями.
16 Для сравнения с недавним исследованием аутизма 8 мы дополнительно представляем результаты анализов при MAF ≤5%.В аутосомном анализе варианты были исключены, если они превышали заданный порог MAF в проекте 1000 геномов, EVS или среди болгарских родительских хромосом. Для анализа Х-хромосом варианты были исключены, если они превышали данный порог MAF среди матерей в выборке из болгарской трио. Во все анализы мы включили только несинонимичные точечные мутации.
Анализ набора генов
Мы провели анализ набора генов-кандидатов, основанный на совокупности наборов, значительно обогащенных редкими мутациями, в недавних исследованиях секвенирования экзома шизофрении 1, 2 (дополнительная таблица S1).В поисках нового понимания этого расстройства мы также предприняли негипотезный анализ путей, основанный на аннотациях генной онтологии (GO) (дополнительная таблица S2). Аннотации генов к GO были получены из NCBI gene2go с использованием только аннотаций Homo Sapiens.
Онтология AmiGO (http://www.geneontology.org/GO.downloads.ontology.shtml) использовалась для вычисления каждого родительского термина GO-терминов. Отношения между детьми и родителями между терминами были определены с помощью «is_a» и «part_of» (но не «регулирует»). Родительские термины каждого члена GO, назначенного гену в gene2go, также были назначены этому гену.Термины GO были проверены, если они содержали три или более гена, и в выборке болгарского трио наблюдалось> 5 рецессивных генотипов. Анализ генов проводили отдельно для гетерозиготных, гомозиготных соединений и всех рецессивных генотипов. Основываясь на результатах теста общей нагрузки, наш первичный анализ был сосредоточен на несинонимичных сложных гетерозиготных генотипах с MAF ≤1%, хотя мы представляем полный набор результатов в дополнительном материале.
Для проверки превышения числа пробандов над родителями рецессивных генотипов был использован подход анализа, аналогичный описанному в Kirov et al. 6 Вкратце, изменение отклонения сравнивалось с односторонним анализом дисперсионного теста между следующими двумя моделями логистической регрессии:
Модель 1
Logit (pr (proband)) ~ N рецессивных генотипов в гене набор + N рецессивные генотипы вне набора генов + сайт секвенирования / партия
Модель 2
Logit (pr (proband)) ~ N рецессивные генотипы вне набора генов + сайт секвенирования / партия
Включение N рецессивного генотипы вне набора генов корректируют различия в экзомном бремени рецессивных генотипов между пробандами и родителями.Образцы были обработаны шестью партиями в Медицинской школе Икана на горе Синай и в Институте Сэнгера Wellcome Trust, а также в восьми партиях в Институте Броуда. Все члены болгарской семьи были обработаны в одном пакете. Мы включили ковариату для сайта секвенирования (The Broad Institute, The Icahn School of Medicine на Mount Sinai или The Wellcome Trust Sanger Institute) и партии секвенирования для контроля возможных технических вариаций между сайтами и партиями. В анализе набора генов-кандидатов значения P были скорректированы для множественного тестирования путем случайной перестановки статуса пробанд / родитель, повторения анализа логистической регрессии для всех протестированных путей и сравнения значения теста P с наиболее значимым путем. P – значение, созданное в переставленных данных.Всего было использовано 10 000 перестановок для получения скорректированных значений P-. Тот же подход перестановки был использован для генерации специфичных для пути значений P , когда количество рецессивных генотипов, попадающих в путь, было небольшим (что делало асимптотические распределения ненадежными). Поскольку выполнение перестановок для большого количества наборов в анализе пути GO было вычислительно непрактичным, мы отмечаем в результатах, выдерживает ли какой-либо набор генов поправку Бонферрони для множественного тестирования.
Данные массива экзома
Чип экзома разработан для генотипирования редких вариантов кодирования, ранее наблюдавшихся в наборах данных секвенирования (http: // genome.sph.umich.edu/wiki/Exome_Chip_Design). Наша выборка массива экзомов содержит 5585 случаев шизофрении (определение описано в Rees et al. 3 ) и 8103 контрольных группы, взятых из Службы крови Великобритании и британских когорт по рождению 1958 года. 27, 28, 29 Эти контрольные образцы не проверялись на психические заболевания. Полная информация об этом образце и анализе дана в параллельной рукописи (Richards et al , в стадии подготовки). Вкратце, SKAT-O 30 использовался для изучения генов и / или наборов генов, которые были в значительной степени связаны с шизофренией при анализе рецессивного наследования в болгарской тройке.Анализ чипа экзома ограничивался несинонимичными однонуклеотидными полиморфизмами с MAF ≤0,1%. Здесь используется более низкий порог частоты, поскольку мы не тестируем рецессивную модель (см. Выше комментарии о фазировании), а варианты с MAF ≤0,1% показали наиболее убедительные доказательства обогащения в недавнем исследовании секвенирования экзома шизофрении. 2
De novo Анализ обогащения набора геновDe novo мутации от контрольных лиц и от лиц с шизофренией, РАС и ID были получены из многочисленных публикаций, как обобщено в Fromer et al. 1 Метод, используемый для тестирования на обогащение набора генов de novo , был описан ранее 1 и учитывает вероятность появления N de novo мутаций в наборе генов большой длины ( S ) с поправкой на последовательность покрытия. Случайное размещение наблюдаемого числа de novo мутаций использовали для получения ожидаемого числа мутаций в наборе генов под нулем. Следующее уравнение, как описано в Fromer et al., 1 использовалось для расчета обогащения набора генов. P -значения:
, где N permi – количество случайно сгенерированных мутаций в данном наборе генов, а N obs – число наблюдаемых мутаций в данном наборе генов.
Коэффициенты инбридинга
Коэффициент инбридинга (статистика F) для каждого образца был получен с помощью PLINK 31 с использованием ранее опубликованных данных генотипирования однонуклеотидного полиморфизма. 6, 7
Тайваньская выборка родитель-пробанд
Репликация важных результатов анализа болгарских троек искали в фазе 1 тайваньской выборки родитель-потомок, страдающей шизофренией ( N = 614 троек). Полную информацию об установлении и секвенировании тайваньского образца репликации родитель-пробанд можно найти в дополнительных материалах (раздел 2). Вкратце, тайваньский образец был секвенирован в Институте Броуда с использованием парного секвенирования всего экзома, выполненного на секвенаторах Illumina HiSeq.Подобно болгарской когорте, чтения были сопоставлены с эталонным геномом человека (hg19) и вариантами, вызванными с использованием конвейера BWA / Picard / GATK. Были выявлены и проанализированы рецессивные генотипы теми же методами, что и для болгарских троек. Варианты из тайваньской выборки были исключены, если они имели MAF выше заданного порога либо в проекте 1000 геномов (все популяции), либо в EVS (все популяции), либо среди тайваньских родительских хромосом. Фильтрация вариантов по MAF, полученным из тайваньских родительских хромосом, будет учитывать различия в частоте аллелей, которые существуют между тайваньским и европейским населением.
Энтеровирусы как возбудители новых инфекционных заболеваний
Abubakar S, Shafee N, Chee HY (1998). Вспышка летальной детской вирусной инфекции в Сараваке, Малайзия, в 1997 году: инокуляция клинических образцов пациентов вызывает апоптоз in vitro. Malays J Pathol 71–81.
Александр Дж. П., младший, Баден Л., Палланш Массачусетс, Андерсон Л. Дж. (1994). Инфекции, вызванные энтеровирусом 71, и неврологические заболевания – США, 1977–1991 гг. J Заразить Dis 169 : 905–908.
PubMed Google Scholar
Андрус Дж. К., Штребель П. М., де Квадрос Калифорния, Олив Дж. М. (1995). Риск вакцино-ассоциированного паралитического полиомиелита в Латинской Америке, 1989–91. Bull World Health Organ 33–40.
Арола А., Сантти Дж., Руусканен О., Халонен П., Хюипия Т. (1996). Идентификация энтеровирусов в клинических образцах с помощью конкурентной ПЦР с последующим генетическим типированием с использованием анализа последовательности. Дж Клини Микробиол 34 : 313–318.
CAS Google Scholar
Avellon A, Casas I, Trallero G, Perez C, Tenorio A, Palacios G (2003). Молекулярный анализ изолятов эховируса 13 и асептического менингита, Испания. Emerg Infect Dis 9 : 934–941.
CAS PubMed Google Scholar
Белл Э.Дж., Маккартни Р.А. (1984). Исследование инфекций, вызванных вирусом Коксаки B, 1972–1983 гг. J Hyg 93 : 197–203.
CAS Статья Google Scholar
Бергельсон Дж. М., Чен М., Соломон К. Р., Сент-Джон Н. Ф., Лин Х., Финберг Р. В. (1994). Фактор ускорения распада (CD55), гликозилфосфатидилинозитол-заякоренный регуляторный белок комплемента, является рецептором для нескольких эховирусов. Proc Nat Acad Sci U S A 91 : 6245–6248.
CAS Статья Google Scholar
Бергельсон Дж. М., Каннингем Дж. А., Дрогетт Дж., Курт-Джонс Е. А., Критивас А., Хонг Дж. С., Хорвиц М. С., Кроуэлл Р. Л., Финберг Р. В. (1997). Выделение общего рецептора для вирусов Коксаки B и аденовирусов 2 и 5. Science 275 : 1320–1323.
CAS PubMed Статья Google Scholar
Бергельсон Дж. М., Шепли М. П., Чан BMC, Хемлер М. Е., Финберг Р. В. (1992).Идентификация интегрина VLA-2 как рецептора эховируса 1. Science 255 : 1718–1720.
CAS PubMed Статья Google Scholar
Бломберг Дж., Лик Э., Альфорс К., Джонссон Т., Волонтис С., Зейпель Г.В. (1974). Письмо: новый тип энтеровируса, связанный с эпидемией асептического менингита и / или болезней рук, ног и рта. Ланцет 2 : 112.
CAS PubMed Статья Google Scholar
Brown BA, Oberste MS, Alexander JP Jr, Kennett ML, Pallansch MA (1999). Молекулярная эпидемиология и эволюция штамма энтеровируса 71, выделенного с 1970 по 1998 год. J Virol 73 : 9969–9975.
CAS PubMed Google Scholar
Brown B, Oberste MS, Maher K, Pallansch MA (2003).Полное геномное секвенирование показывает, что полиовирусы и представители человеческого энтеровируса вида C тесно связаны в области кодирования некапсида. J Вирол 77 : 8973–8984.
CAS PubMed Статья Google Scholar
Браун Ф, Талбот П., Берроуз Р. (1973). Антигенные различия между изолятами вируса везикулярной болезни свиней и их родство с вирусом Коксаки B5. Природа 245 : 315–316.
CAS PubMed Статья Google Scholar
Кардоса М.Дж., Перера Д., Браун Б.А., Чеон Д., Чан Х.М., Чан К.П., Чо Х., Макминн П. (2003). Молекулярная эпидемиология штаммов энтеровируса человека 71 и недавние вспышки в Азиатско-Тихоокеанском регионе: сравнительный анализ генов VP1 и VP4. Emerg Infect Dis 461–468.
Каро В., Гийо С., Дельпейру Ф., Крейник Р. (2001).Молекулярная стратегия «серотипирования» энтеровирусов человека. J Gen Virol 82 : 79–91.
CAS PubMed Google Scholar
Карсон С.Д., Чепмен Н.Н., Трейси С.М. (1997). Очистка предполагаемого рецептора вируса Коксаки В из клеток HeLa. Biochem Biophys Res Commun 233 : 325–328.
CAS PubMed Статья Google Scholar
Casas I, Palacios GF, Trallero G, Cisterna D, Freire MC, Tenorio A (2001).Молекулярная характеристика энтеровирусов человека в клинических образцах: сравнение областей полимеразы VP2, VP1 и РНК с использованием вложенных ПЦР-анализов RT и прямого секвенирования продуктов. J Med Virol 65 : 138–148.
CAS PubMed Статья Google Scholar
Центры по контролю и профилактике заболеваний (1997). Эпиднадзор за энтеровирусами, не связанными с полиомиелитом – США, 1993–1996 гг. MMWR Morb Mort Wkly Rep 46 : 748–750.
Google Scholar
Центры по контролю и профилактике заболеваний (2000). Эпиднадзор за энтеровирусами – США, 1997–1999 гг. MMWR Morb Mort Wkly Rep 49 : 913–916.
Google Scholar
Центры по контролю и профилактике заболеваний (2001).Острый вялый паралич, связанный с циркулирующим полиовирусом вакцинного происхождения – Филиппины, 2001. MMWR Morb Mort Wkly Rep 50 : 874–875.
Google Scholar
Центры по контролю и профилактике заболеваний (2002). Острый вялый паралич, связанный с циркулирующим полиовирусом вакцинного происхождения – Мадагаскар, 2002. MMWR Morb Mort Wkly Rep 51 : 622.
Google Scholar
Центры по контролю и профилактике заболеваний (2004 г.). Прогресс на пути к глобальной ликвидации полиомиелита, январь 2003 г. – апрель 2004 г. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 532–535.
Chan LG, Parashar UD, Lye MS, Ong FGL, Zaki SR, Alexander JP, Ho KK, Han LL, Pallansch MA, Abu Bakar S, Jegathesan M, Anderson LJ (2000). Смерть детей во время вспышки болезни рук, ног и рта в Сараваке, Малайзия: клинические и патологические характеристики болезни. Clin Infect Dis 31 : 678–683.
CAS PubMed Статья Google Scholar
Чанг Л.Й., Хуанг Ю.К., Лин Т.Й. (1998). Фульминантный нейрогенный отек легких с заболеваниями рук, ног и рта. Ланцет 352 : 367–368.
CAS PubMed Статья Google Scholar
Chonmaitree T, Menegus MA, Schervish-Swierkosz EM, Schwalenstocker E (1981).Инфекция Enterovirus 71: отчет о вспышке с двумя случаями паралича и обзор литературы. Педиатрия 489–493.
Chu PY, Lin KH, Hwang KP, Chou LC, Wang CF, Shih SR, Wang JR, Shimada Y, Ishiko H (2001). Молекулярная эпидемиология энтеровируса 71 на Тайване. Арка Вирол 146 : 589–600.
CAS PubMed Статья Google Scholar
Чумаков М., Ворошилова М., Шиндаров Л., Лаврова И., Грачева Л., Королева Г., Василенко С., Бродварова И., Нойколова М., Гюрова С., Гачева М., Митов Г., Нинов Н., Цилка Э, Робинсон И., Фролова М, Башкирцев В, Мартьянова Л, Родин В (1979).Энтеровирус 71 выделен в случаях эпидемического полиомиелитоподобного заболевания в Болгарии. Арка Вирол 60 : 329–340.
CAS PubMed Статья Google Scholar
Комитет по энтеровирусам (1962). Классификация энтеровирусов человека. Вирусология 16 : 501–504.
Артикул Google Scholar
da Silva EE, Winkler MT, Pallansch MA (1996).Роль энтеровируса 71 в развитии острого вялого паралича после ликвидации полиовируса в Бразилии. Emerg Infect Dis 231–233.
Далакас MC (1995). Энтеровирусы и нервно-мышечные заболевания человека. В: Энтеровирусные инфекции человека . Ротбарт HA (ред.). Вашингтон, округ Колумбия: ASM Press, стр. 387–398.
Google Scholar
Датчанин Л., Яресова И. (1985). Микротест нейтрализации серотипами вируса Коксаки человека и эховируса. J Hyg Epidemiol, Microbiol Immunol 29 : 399–408.
CAS Google Scholar
де Квадрос Калифорния, Херш Б.С., Олив Дж. М., Андрус Дж. К., да Силвейра С. М., Карраско, Пенсильвания (1997). Ликвидация дикого полиовируса в Америке: эпиднадзор за острым вялым параличом, 1988–1995 гг. J Заразить Dis 175 : S37-S42.
PubMed Google Scholar
Дейбель Р., Фланаган Т.Д., Смит В. (1977).Инфекции центральной нервной системы. Этиологические и эпидемиологические наблюдения в штате Нью-Йорк, 1975 г. N Y State J Med 77 : 1398–1404.
CAS PubMed Google Scholar
Доррис Р., Тер Меулен В. (1983). Специфичность антител IgM к острым инфекциям, вызванным вирусом Коксаки В у человека, проанализирована с помощью непрямого твердофазного иммуноферментного анализа и метода иммуноблоттинга. J Gen Virol 64 : 159–167.
PubMed Статья Google Scholar
Дребот М.А., Малдерс М.Н., Кэмпбелл Дж. Дж., Кью О.М., Фонсека К., Стронг Д., Ли С.Х. (1997). Молекулярное обнаружение завоза дикого полиовируса типа 3 в Канаду из Нидерландов в 1993 году. Appl Environ Microbiol 63 : 519–523.
CAS PubMed Google Scholar
Gauntt CJ (1997).Роль гуморального ответа при заболевании, вызванном вирусом Коксаки В. Curr Top Микробиол Иммунол 223 : 259–282.
CAS PubMed Google Scholar
Гилберт Г.Л., Диксон К.Э., Уотерс М.Дж., Кеннетт М.Л., Лэнд С.А., Снеддон М. (1988). Вспышка энтеровирусной инфекции 71 в Виктории, Австралия, с высокой частотой неврологических заболеваний. Pediatr Infect Dis J 484–488 .Горбач С.Л., Бартлетт Дж. Г., Блэклоу Н. Р. (ред.). (1992). Инфекционные болезни , 2-е изд. Филадельфия: У. Б. Сондерс.
Google Scholar
Graves JH (1973). Серологическая взаимосвязь вируса везикулярной болезни свиней и вируса Коксаки B5. Природа 245 : 314–315.
CAS PubMed Статья Google Scholar
Эрреро Л.Дж., Ли К.С., Харрелбринк Р.Дж., Чуа Б.Х., Чуа КБ, Макминн ПК (2003).Молекулярная эпидемиология энтеровируса 71 на полуострове Малайзия, 1997–2000 гг. Арка Вирол 148 : 1369–1385.
CAS PubMed Статья Google Scholar
Хо М (2000). Энтеровирус 71: вирус, его инфекции и вспышки. J Microbiol Immunol Infect 33 : 205–216.
CAS PubMed Google Scholar
Хо М., Чен Э.Р., Сюй К.Х., Тву С.Дж., Чен К.Т., Цай С.Ф., Ван Дж.Р., Ши С.Р. (1999).Эпидемия энтеровирусной 71 инфекции на Тайване. Тайваньская рабочая группа по эпидемии энтеровируса. N Engl J Med 929–935.
Хуанг С.К., Лю С.К., Чанг Ю.С., Чен С.Й., Ван С.Т., Йе Т.Ф. (1999). Неврологические осложнения у детей с энтеровирусной инфекцией 71. N Английский JMed 341 : 936–942.
CAS Статья Google Scholar
Хиоти Х., Тейлор К.В. (2002).Роль вирусов в диабете человека. Диабетология 45 : 1353–1561.
CAS PubMed Статья Google Scholar
Исико Х., Шимада Й., Йонаха М., Хашимото О., Хаяси А., Сакаэ К., Такеда Н. (2002). Молекулярная диагностика энтеровирусов человека на основе филогенетической классификации с использованием последовательности VP4. J Заразить Dis 185 : 744–754.
CAS PubMed Статья Google Scholar
Ишимару Ю., Накано С., Ямаока К., Таками С. (1980). Вспышки энтеровирусов кистей, стоп и ротовой полости 71. Высокая частота осложнений со стороны центральной нервной системы. Arch Dis Child 583–588.
Kalter SS, Heberling RL (1971). Сравнительная вирусология приматов. Бактериол Ред. 35 : 310–364.
CAS PubMed Google Scholar
Кандольф Р. (1996). [Миокардит и кардиомиопатия]. Верх DTSCH Ges Pathol 80 : 127–138.
CAS PubMed Google Scholar
Кирни М.Т., Коттон Дж. М., Ричардсон П. Дж., Шах А. М. (2001). Вирусный миокардит и дилатационная кардиомиопатия: механизмы, проявления и лечение. Postgrad Med J 77 : 4–10.
CAS PubMed Статья Google Scholar
Кеннетт М.Л., Берч С.Дж., Льюис Ф.А., Юнг А.П., Локарнини С.А., Gust ID (1974). Энтеровирусная инфекция типа 71 в Мельбурне. Орган здоровья Bull World 51 : 609–615.
CAS PubMed Google Scholar
Кью О., Моррис-Глазго В., Ландаверде М., Бернс К., Шоу Дж., Гариб З., Андре Дж., Блэкман Е., Фриман С. Джей, Хорба Дж., Саттер Р., Тамбини Дж., Венцель Л., Педрейра К., Лендер Ф. , Симидзу Х., Йонеяма Т., Миямура Т., ван дер Аворт Х., Оберсте М.С., Килпатрик Д., Кочи С., Палланш М., де Квадрос С. (2002).Вспышка полиомиелита в Hispaniola, связанная с циркулирующим полиовирусом вакцинного происхождения 1 типа. Наука 296 : 356–359.
CAS PubMed Статья Google Scholar
Кью О.М., Палланш М.А. (2002). Механизм эрадикации полиовируса. В: Молекулярная биология пикорнавирусов . Семлер Б.Л., Виммер Э. (ред.). Вашингтон, округ Колумбия: ASM Press, стр. 481–491.
Google Scholar
Ким К.С., Хуфнагель Г., Чепмен Н., Трейси С. (2001).Вирусы Коксаки и миокардит группы В. Rev Med Virol 11 : 355–368.
CAS PubMed Статья Google Scholar
Кинг AMQ, Браун Ф, Кристиан П., Хови Т., Хюипия Т., Ноулз, штат Нью-Джерси, Лимон С.М., Минор П.Д., Пальменберг А.С., Скерн Т., Стэнвей Дж. (2000). Picornaviridae. В: Таксономия вирусов. Седьмой отчет Международного комитета по таксономии вирусов . Van Regenmortel MHV, Fauquet CM, Bishop DHL, Carstens EB, Estes MK, Lemon SM, Maniloff J, Mayo MA, McGeoch DJ, Pringle CR, Wickner RB (ред.).Сан-Диего: Academic Press, стр. 657–678.
Google Scholar
Klingel K, Stephan S, Sauter M, Zell R, McManus BM, Bultmann B, Kandolf R (1996). Патогенез мышиного энтеровирусного миокардита: распространение вируса и мишени для иммунных клеток. J Вирол 70 : 8888–8895.
CAS PubMed Google Scholar
Komatsu H, Shimizu Y, Takeuchi Y, Ishiko H, Takada H (1999).Вспышка тяжелого неврологического заболевания, связанного с инфекцией Enterovirus 71. Pediatr Neurol 17–23.
Лау RC (1983). Инфекции вируса Коксаки B у пациентов Новой Зеландии с сердечными и внесердечными заболеваниями. J Med Virol 11 : 131–137.
CAS PubMed Статья Google Scholar
Лейникки П. (1998). Вирусы и диабет 1 типа: неуловимые проблемы и неуловимые ответы. Clin Diagn Virol 9 : 65–66.
Артикул Google Scholar
Лин TY, Twu SJ, Ho MS, Chang LY, Lee CY (2003). Вспышки энтеровируса 71, Тайвань: возникновение и распознавание. Emerg Infect Dis 291–293.
Линдберг А.М., Андерссон П., Саволайнен С., Малдерс М.Н., Хови Т. (2003). Эволюция генома энтеровируса человека B: несовпадение филогении областей VP1 и 3CD указывает на частую рекомбинацию внутри вида. J Gen Virol 84 : 1223–1235.
CAS PubMed Статья Google Scholar
Лукашев А.Н., Лашкевич В.А., Иванова О.Е., Королева Г.А., Хинкканен А.Е., Илонен Дж. (2003). Рекомбинация в циркулирующих энтеровирусах. J Вирол 77 : 10423–10431.
CAS PubMed Статья Google Scholar
Лукашев А.Н., Лашкевич В.А., Королева Г.А., Илонен Дж., Хинкканен А.Е. (2004).Рекомбинация штаммов энтеровирусов, вызывающих увеит. J Gen Virol 85 : 463–470.
CAS PubMed Статья Google Scholar
Lum LC, Wong KT, Lam SK, Chua KB, Goh AY (1998). Нейрогенный отек легких и энтеровирусный энцефаломиелит 71 [письмо]. Ланцет 352 : 1391.
CAS PubMed Статья Google Scholar
Манджунатх Н., Балая С., Сет П. (1982).Серологическое исследование на нейтрализующие антитела против вирусов Коксаки группы B в нормальной популяции в районе Дели. Индийский J Med Res 76 : 656–661.
CAS PubMed Google Scholar
Манзара С., Мускилло М., Ла Роса Дж., Марианелли С., Каттани П., Фадда Дж. (2002). Молекулярная идентификация и типирование энтеровирусов, выделенных из клинических образцов. J Clin Microbiol 40 : 4554–4560.
CAS PubMed Статья Google Scholar
Маргалит М., Фаттал Б., Шувал Н.И., Мораг А. (1986). Распространенность антител к энтеровирусам и вирусу ветряной оспы среди жителей и зарубежных добровольцев в сельскохозяйственных поселениях Израиля. J Med Virol 20 : 189–197.
CAS PubMed Статья Google Scholar
Мартино Т.А., Лю П.П., Петрич М., Соле М.Дж. (1995).Энтеровирусный миокардит и кардиомиопатия: обзор клинических и экспериментальных исследований. В: Энтеровирусные инфекции человека . Ротбарт HA (ред.). Вашингтон, округ Колумбия: ASM Press, стр. 291–351.
Google Scholar
Макминн П., Линдси К., Перера Д., Чан Х.М., Чан К.П., Кардоса М.Дж. (2001). Филогенетический анализ штамма энтеровируса 71, выделенного во время связанных эпидемий в Малайзии, Сингапуре и Западной Австралии. J Вирол 75 : 7732–7738.
CAS PubMed Статья Google Scholar
МакМинн П., Стратов И., Доуз Г. (1999). Вспышка энтеровируса 71 в Западной Австралии, связанная с острым вялым параличом. Предварительный отчет. Commun Dis Intell , 199.
Melnick JL (1984). Инфекции, вызванные энтеровирусом 71 типа: разнообразная клиническая картина, иногда напоминающая паралитический полиомиелит. Ред. Заразить Dis S387 – S390.
Мелник Дж. Л. (1997).Полиовирус и другие энтеровирусы. В: Вирусные инфекции человека: эпидемиология и контроль . Каслоу Р.А. (ред.). Нью-Йорк: Медицинская книга пленума, стр. 583–663.
Google Scholar
Mendelsohn CL, Wimmer E, Racaniello VR (1989). Клеточный рецептор полиовируса: молекулярное клонирование, нуклеотидная последовательность и экспрессия нового члена суперсемейства иммуноглобулинов. Ячейка 56 : 855–865.
CAS PubMed Статья Google Scholar
Миркович Р. Р., Коно Р., Инь-Мерфи М., Сойер Р., Шмидт Н. Дж., Мельник Дж. Л. (1973). Энтеровирус типа 70: этиологический агент пандемического острого геморрагического конъюнктивита. Орган здоровья Bull World 49 : 341–346.
CAS PubMed Google Scholar
Mirkovic RR, Schmidt NJ, Yin-Murphy M, Melnick JL (1974).Энтеровирусная этиология эпидемии острого конъюнктивита в Сингапуре 1970 г. Интервирология 4 : 119–127.
CAS PubMed Google Scholar
Модлин Дж. Ф. (1990). Вирусы Коксаки, эховирусы и новые энтеровирусы. В: Принципы и практика инфекционных болезней . Манделл Г.Л., Дуглас Р.Дж., Беннетт Дж. Э. (ред.). Нью-Йорк: Джон Вили и сыновья, стр. 1367–1383.
Google Scholar
Мур М. (1982). Энтеровирусное заболевание в США, 1970–1979 гг. J Заразить Dis 146 : 103–108.
CAS PubMed Google Scholar
Мораг А., Маргалит М., Шувал Н.И., Фаттал Б. (1984). Приобретение антител к различным вирусам Коксаки и Эхо, а также вирусу гепатита А в сельскохозяйственных общинных поселениях Израиля. J Med Virol 14 : 39–47.
CAS PubMed Статья Google Scholar
Моренс Д.М., Палланш М.А. (1995). Эпидемиология. В: Энтеровирусные инфекции человека . Ротбарт HA (ред.). Вашингтон, округ Колумбия: ASM Press, стр. 3–23.
Google Scholar
Моренс Д.М., Цвейгафт Р.М., Брайан Дж. М. (1979). Неполиомиелитное энтеровирусное заболевание в США, 1971–1975 гг. Int J Эпидемиол 8 : 49–54.
CAS PubMed Статья Google Scholar
Мукундан П., Джон Т.Дж. (1983). Распространенность и титры нейтрализующих антител к вирусам Коксаки группы B. Индийский J Med Res 77 : 577–589.
CAS PubMed Google Scholar
Малдерс М.Н., Салминен М., Калккинен Н., Хови Т. (2000).Молекулярная эпидемиология вируса Коксаки B4 и раскрытие правильного сайта расщепления VP1 / 2A (про): доказательства высокого геномного разнообразия и долгосрочной эндемичности отдельных генотипов. J Gen Virol 81 : 803–812.
CAS PubMed Google Scholar
Маллинз Дж. А., Хецуриани Н., Никс В. А., Оберсте М. С., Ламонте А., Килпатрик Д. Р., Данн Дж., Лангер Дж., Макминн П., Хуанг К. С., Гримвуд К., Хуанг С., Палланш М.А. (2004).Появление эховируса 13 типа как известного энтеровируса. Clin Infect Dis 38 : 70–77.
PubMed Статья Google Scholar
Надь Г., Такаци С., Кукан Е., Михай И., Домок И. (1982). Вирусологическая диагностика инфекций энтеровируса 71 типа: опыт, полученный во время эпидемии острых заболеваний ЦНС в Венгрии в 1978 году. Arch Virol 71 : 217–227.
CAS PubMed Статья Google Scholar
Norder H, Bjerregaard L, Magnius LO (2001). Гомотипические эховирусы обладают гомологией аминоконцевой последовательности VP1, подходящей для типирования. J Med Virol 63 : 35–44.
CAS PubMed Статья Google Scholar
Norder H, Bjerregaard L, Magnius LO (2002).Последовательность открытой рамки считывания штамма азиатского энтеровируса 73 показывает, что прототип из Калифорнии является рекомбинантным. J Gen Virol 83 : 1721–1728.
CAS PubMed Google Scholar
Norder H, Bjerregaard L, Magnius L, Lina B, Aymard M, Chomel J-J (2003). Секвенирование «нетипичных» энтеровирусов выявило два новых типа, EV-77 и EV-78, внутри человеческого энтеровируса типа B и замены в петле BC белка VP1 для известных типов. J Gen Virol 84 : 827–836.
CAS PubMed Статья Google Scholar
Оберсте М., Шнурр Д., Махер К., аль-Бусаиди С., Палланш М. (2001). Молекулярная идентификация новых пикорнавирусов и характеристика предполагаемого серотипа энтеровируса 73. J Gen Virol 82 : 409–416.
CAS PubMed Google Scholar
Oberste MS, Maher K, Flemister MR, Marchetti G, Kilpatrick DR, Pallansch MA (2000a).Сравнение классического и молекулярного подходов к идентификации нетипичных энтеровирусов. J Clin Microbiol 38 : 1170–1174.
CAS PubMed Google Scholar
Oberste MS, Maher K, Kennett ML, Campbell JJ, Carpenter MS, Schnurr D, Pallansch MA (1999a). Молекулярная эпидемиология и генетическое разнообразие эховируса типа 30 (E30): генотип коррелирует с временной динамикой выделения E30. J Clin Microbiol 37 : 3928–3933.
CAS PubMed Google Scholar
Оберсте М.С., Махер К., Килпатрик Д.Р., Флемистер М.Р., Браун Б.А., Палланш М.А. (1999b). Типирование энтеровирусов человека путем частичного секвенирования VP1. J Clin Microbiol 37 : 1288–1293.
CAS PubMed Google Scholar
Oberste MS, Maher K, Kilpatrick DR, Pallansch MA (1999d).Молекулярная эволюция энтеровирусов человека: корреляция серотипа с последовательностью VP1 и применение к классификации пикорнавирусов. J Вирол 73 : 1941–1948.
CAS PubMed Google Scholar
Oberste MS, Michele SM, Maher K, Schnurr D, Cisterna D, Uddin M, Norder H, Lau C-S, Chomel J-J, Magnius L, Pallansch MA (2004a). Молекулярная идентификация и характеристика двух предложенных новых серотипов энтеровирусов, EV74 и EV75. J Gen Virol 85 : 565.
Google Scholar
Oberste MS, Nix WA, Maher K, Pallansch MA (2003). Улучшенная молекулярная идентификация энтеровирусов с помощью ОТ-ПЦР и секвенирования ампликонов. J Clin Virol 26 : 375–377.
CAS PubMed Статья Google Scholar
Oberste MS, Penaranda S, Maher K, Pallansch MA (2004b).Полные последовательности генома всех представителей вида Энтеровирус человека A. J Gen Virol 85 : 1597–1607.
CAS PubMed Статья Google Scholar
Palacios G, Casas I, Cisterna D, Trallero G, Tenorio A, Freire C (2002a). Молекулярная эпидемиология эховируса 30: временная циркуляция и преобладание отдельных линий. J Вирол 76 : 4940–4949.
CAS PubMed Статья Google Scholar
Palacios G, Casas I, Tenorio A, Freire C (2002b). Молекулярная идентификация энтеровируса путем анализа частичной области генома VP1 различными методами. J Clin Microbiol 40 : 182–192.
CAS PubMed Статья Google Scholar
Палланш М.А. (2000).Острый геморрагический конъюнктивит. В: Тропическая медицина Хантера . Strickland GT (ред.). Филадельфия: WB, Saunders, стр. 226–227.
Google Scholar
Палланш М.А., Оберсте М.С. (2003). Вирус Коксаки, эховирус и другие энтеровирусы. В: Инфекционные болезни . Горбач С.Л., Бартлетт Дж. Г., Блэклоу Н. Р. (ред.). Филадельфия: Липпинкотт, Уильямс и Уилкинс, стр. 2347–2053.
Google Scholar
Палланш М.А., Роос Р.П. (2001).Энтеровирусы: полиовирусы, вирусы Коксаки, эховирусы и новые энтеровирусы. В: Области вирусологии . Knipe DM, Howley PM, Griffin DE, Lamb RA, Martin MA, Roizman B, Straus SE (ред.). Филадельфия: Липпинкотт Уильямс и Уилкинс, стр. 723–775.
Google Scholar
Панель пикорнавирусов (1963). Пикорнавирусы: классификация девяти новых типов. Наука 141 : 153–154.
Артикул Google Scholar
Паттисон младший (1983). Тесты на IgM к вирусу Коксаки B. J Hyg 90 : 327–332.
CAS Статья Google Scholar
Реверс М., Аткинсон М. (1995). Возможная роль энтеровирусов при сахарном диабете. В: Энтеровирусные инфекции человека . Ротбарт HA (ред.).Вашингтон, округ Колумбия: ASMPress, стр. 353–385.
Google Scholar
Rico-Hesse R, Pallansch MA, Nottay BK, Kew OM (1987). Географическое распространение генотипов дикого полиовируса типа 1. Вирусология 160 : 311–322.
CAS PubMed Статья Google Scholar
Роббинс, де Куадрос, Калифорния (1997). Сертификация искоренения местной передачи дикого полиовируса в Америке. J Заразить Dis 175 : S281-S285.
PubMed Google Scholar
Ройвайнен М., Пиирайнен Л., Хови Т., Виртанен И., Рииконен Т., Хейно Дж., Хайпия Т. (1994). Проникновение вируса Коксаки А9 в клетки-хозяева: специфические взаимодействия с интегрином α v β 3 , рецептором витронектина. Вирусология 203 : 357–365.
CAS PubMed Статья Google Scholar
Самуда Г.М., Чанг В.К., Йунг С.Й., Тан П.С. (1987).Моноплегия, вызванная энтеровирусом 71: вспышка в Гонконге. Pediatr Infect Dis J 206–208.
Сантханам С., Чоудхури Д.С. (1984). Антитела против вируса Коксаки В2 у младенцев и детей в Дели. J Commun Dis 16 : 304–306.
CAS PubMed Google Scholar
Santti J, Vainionpää R, Hyypia T (1999). Молекулярное обнаружение и типирование пикорнавирусов человека. Защита от вирусов 62 : 177–183.
CAS PubMed Статья Google Scholar
Саволайнен К., Хови Т., Малдерс М.Н. (2001). Молекулярная эпидемиология эховируса 30 в Европе: последовательность доминантных подлиний в пределах одного основного генотипа. Арка Вирол 146 : 521–537.
CAS PubMed Статья Google Scholar
Шмидт, штат Нью-Джерси, Леннетт Э. Х., Хо Х. Х. (1974).По-видимому, новый энтеровирус, выделенный от пациентов с заболеванием центральной нервной системы. J Заразить Dis 129 : 304–309.
CAS PubMed Google Scholar
Шнайдер-Шаулис Дж. (2000). Клеточные рецепторы вирусов: ссылки на тропизм и патогенез. J Gen Virol 81 ( Pt 6 ): 1413–1429.
CAS PubMed Google Scholar
Шафрен Д.Р., Дорахи Д.Д., Грейв С.Дж., Бернс Г.Ф., Барри Р.Д. (1997).Клетки мыши, экспрессирующие молекулу-1 межклеточной адгезии человека, восприимчивы к инфицированию вирусом Коксаки А21. J Вирол 71 : 785–789.
CAS PubMed Google Scholar
Симидзу Х., Утама А., Оннимала Н., Ли К., Ли-Би З., Ю-Цзе М., Понгсуванна Ю., Миямура Т. (2004). Молекулярная эпидемиология энтеровирусной инфекции 71 в Регионе Западной части Тихого океана. Педиатр Int 46 : 231–235.
PubMed Статья Google Scholar
Шиндаров Л.М., Чумаков М.П., Ворошилова М.К., Божинов С., Василенко С.М., Иорданов И., Киров И.Д., Каменов Э., Лещинская Е.В., Митов Г., Робинсон И.А., Сивчев С., Стаиков С. (1979). Эпидемиологические, клинические и патоморфологические характеристики эпидемического полиомиелитоподобного заболевания, вызываемого энтеровирусом 71. J Hyg Epidemiol Microbiol Immunol 284–295.
Шульман Л.М., Усадьба Y, Хандшер Р., Дельпейру Ф., Макдоноу М.Дж., Хальмут Т., Зильберштейн И., Альфандари Дж., Куэй Дж., Фишер Т., Робинов Дж., Кью О.М., Крейник Р., Мендельсон Э. (2000).Молекулярная и антигенная характеристика высокоразвитого производного штамма пероральной полиовакцины 2 типа, выделенного из сточных вод в Израиле. J Clin Microbiol 3729–3734.
Стрикас Р.А., Андерсон Л.Дж., Паркер Р.А. (1986). Временные и географические особенности изолятов неполиомиелитного энтеровируса в США, 1970–1983 гг. J Infecti Dis 153 : 346–351.
CAS Google Scholar
Tracy S, Hofling K, Pirruccello S, Lane PH, Reyna SM, Gauntt CJ (2000).Группа B миокардит и панкреатит, вызванные вирусом Коксаки: связь между фенотипами вирусной вирулентности у мышей. J Med Virol 62 : 70–81.
CAS PubMed Статья Google Scholar
Trallero G, Casas I, Tenorio A, Echevarria JE, Castellanos A, Lozano A, Brena PP (2000). Энтеровирусы в Испании: вирусологические и эпидемиологические исследования в течение 10 лет (1988–97). Эпидемиол. Инфекция 497–506.
Уильямс CH, Kajander T, Hyypiä T, Jackson T, Sheppard D, Stanway G (2004). Интегрин α v β 6 является RGD-зависимым рецептором вируса Коксаки A9. J Вирол 78 : 6967–6973.
CAS PubMed Статья Google Scholar
Вудрафф Дж. Ф. (1980). Вирусный миокардит. Обзор. Am J Pathol 101 : 425–484.
CAS PubMed Google Scholar
Всемирная организация здравоохранения (2001 г.). Руководство по вирусологическому исследованию полиомиелита . Женева: Всемирная организация здравоохранения.
Google Scholar
Ямасита К., Миямура К., Ямадера С., Като Н., Акацука М., Иноуэ С., Ямадзаки С. (1992). Энтеровирусный асептический менингит в Японии, 1981–1991. Отчет Национального эпидемиологического надзора за инфекционными агентами в Японии. Jpn J Med Sci Biol 151–161.
Ян Дж. Дж., Ван Дж. Р., Лю Си Си, Ян Х. Б., Су Ай Дж. (2000). Вспышка энтеровирусной инфекции 71 на Тайване в 1998 г .: всестороннее патологическое, вирусологическое и молекулярное исследование случая молниеносного энцефалита. J Clin Virol 17 : 13–22.
CAS PubMed Статья Google Scholar
Ян Си-Ф, Нагиб Т., Ян С.-Й, Наср Э, Джорба Дж, Ахмед Н., Кампаньоли Р., Ван дер Авурт Х., Симидзу Х., Йонеяма Т., Миямура Т., Палланш М., Кью О. (2003).Циркуляция эндемического полиовируса вакцинного происхождения типа 2 в Египте с 1983 по 1993 год. J Virol 77 : 8366–8377.
CAS PubMed Статья Google Scholar
Йошии Т., Натори К., Коно Р. (1977). Репликация энтеровируса 70 в культурах клеток неприматов. J Gen Virol 36 : 377–384.
CAS PubMed Статья Google Scholar
Zhang G, Haydon DT, Knowles NJ, McCauley JW (1999).Молекулярная эволюция вируса везикулярной болезни свиней. J Gen Virol 80 : 639–651.
CAS PubMed Google Scholar
Zhang G, Wilsden G, Knowles NJ, McCauley JW (1993). Полная нуклеотидная последовательность вируса Коксаки B5 и ее связь с вирусом везикулярной болезни свиней. J Gen Virol 74 : 845–853.
CAS PubMed Статья Google Scholar
Чжан Х, Ли И, Пэн Т., Ааса М., Чжан Л., Ян И, Archard LC (2000).Локализация энтеровирусного антигена в миокарде и других тканях пациентов с заболеваниями сердечной мышцы с помощью улучшенного иммуногистохимического метода. J Histochem Cytochem 48 : 579–584.
CAS PubMed Google Scholar
GADL1 представляет собой многофункциональную декарбоксилазу с тканеспецифической ролью в производстве β-аланина и карнозина
Abstract
Считается, что карнозин и родственные β-аланинсодержащие пептиды являются важными антиоксидантами, буферами pH и нейромодуляторами.Однако их биосинтетические пути и терапевтический потенциал все еще обсуждаются. Это исследование описывает первую модель на животных, лишенную фермента декарбоксилазы глутаминовой кислоты, подобного 1 (GADL1). Мы показываем, что мыши Gadl1 – / – испытывают дефицит β-аланина, карнозина и ансерина, особенно в обонятельной луковице, коре головного мозга и скелетных мышцах. Мыши Gadl1 – / – также обнаруживают снижение тревожности, повышенные уровни маркеров окислительного стресса, изменения в энергетическом и липидном обмене и возрастные изменения.Исследование активного сайта GADL1 показало, что фермент может иметь несколько физиологических субстратов, включая аспартат и цистеинсульфиновую кислоту. Генетические исследования человека показывают сильную связь локуса GADL1 с уровнями карнозина в плазме, субъективным благополучием и мышечной силой. Вместе это показывает многогранную и органоспецифичную роль карнозиновых пептидов и делает мышей с нокаутом Gadl1 универсальной моделью для изучения биологии карнозина и его терапевтического потенциала.
ВВЕДЕНИЕ
Карнозин (β-аланил-1-гистидин) является одним из нескольких дипептидов β-аланина и гистидина, которые обнаруживаются в высоких концентрациях в тканях позвоночных, особенно в тканях мозга и скелетных мышц (SKM). У людей наиболее распространены карнозин и ацетилкарнозин. Напротив, многие животные в основном синтезируют родственные β-аланин-содержащие пептиды ансерин или офидин / баленин посредством метилирования имидазольного фрагмента карнозина в положении 1 или 3 ( 1 , 2 ).Здесь мы называем это семейство родственных пептидов «карнозиновыми пептидами».
Пептиды карнозина могут выполнять множество биологических функций, включая регулирование кальция, буферное действие pH, хелатирование металлов и антиоксидантные эффекты ( 1 ). β-Аланин, а также его дипептидные производные также могут быть нейротрансмиттерами или нейромодуляторами в центральной нервной системе, особенно в обонятельной луковице (OB). У млекопитающих, включая мышей, только две ткани имеют концентрации карнозина в миллимолярном диапазоне, т.е.е., СКМ и ОБ ( 1 , 3 ). Различные расстройства и дисфункции связаны с изменениями метаболизма β-аланина и карнозина. При β-аланинемии и карнозинемии снижение разложения этих соединений связано с неврологическими симптомами ( 4 , 5 ). Напротив, было высказано предположение, что при некоторых возрастных и неврологических заболеваниях, например, болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, рассеянном склерозе (РС) и раке, а также при осложнениях диабета, добавление карнозина может помочь ( 6 ).
Добавка β-аланина увеличивает содержание карнозина и улучшает сократительную способность и производительность мышц SKM человека и грызунов, особенно во время коротких интервалов упражнений ( 7 , 8 ). Эти результаты привели к широкому использованию пищевых добавок с β-аланином, особенно среди спортсменов и солдат ( 9 ). Пищевые добавки с бета-аланином и карнозином также продемонстрировали некоторые многообещающие эффекты при лечении симптомов депрессии, тревоги и аутизма у людей ( 10 ) и моделей на животных ( 11 , 12 ).
Поскольку большинство карнозиновых пептидов после перорального приема гидролизуются в энтероцитах или в кровотоке, организм в основном зависит от синтеза этих пептидов de novo. Пищевая добавка имеет побочные эффекты, но требует ежедневного приема нескольких граммов для увеличения содержания β-аланина и карнозина в мышцах и повышения физической работоспособности ( 13 ). Отсутствие подходящих модельных систем и необходимость поставлять фармакологические количества карнозиновых пептидов вызвали некоторую неопределенность в отношении механизмов действия и безопасности этих соединений.Недавно было показано, что более стабильный синтетический аналог карнозина, карнозинол, защищает от метаболической дисрегуляции и окислительного повреждения ( 14 ).
Синтез β-аланина, по-видимому, является фактором, ограничивающим скорость для уровней карнозинового пептида у млекопитающих ( 15 ). В исследовании крупных геномных ассоциаций (GWA) метаболитов в плазме было установлено, что 86% вариаций уровней карнозина можно отнести к генетическим факторам, что делает этот пептид наиболее наследуемым метаболитом среди всех исследованных соединений ( 16 ) .Тем не менее, остается неясность относительно идентичности генов и белков, участвующих в его синтезе. Карнозинсинтаза 1 (кодируемая CARNS1 ) продуцирует карнозин из β-аланина и гистидина и гомокарнозин из γ-аминомасляной кислоты (ГАМК) и гистидина. В тканях животных β-аланин может продуцироваться путем восстановительной деградации урацила ( 17 ). Напротив, некоторые бактерии продуцируют β-аланин путем α-декарбоксилирования аспарагиновой кислоты (Asp), катализируемого аспартатдекарбоксилазой с помощью ковалентно связанного пирувоильного кофактора ( 18 ).У насекомых аналогичный витамин B6 [пиридоксальфосфат (PLP)] – зависимый фермент l-аспартат-α-декарбоксилаза эволюционировал в результате конвергентной эволюции ( 19 ). Образование карнозина в SKM мышей зависит от витамина B6, что также связано с участием PLP-зависимого фермента в его синтезе у животных ( 20 ).
На основании сходства последовательности с декарбоксилазой глутаминовой кислоты (GAD) PLP-зависимому ферменту GAD-подобному белку 1 (GADL1; декарбоксилаза кислых аминокислот) приписывается возможная роль в синтезе ГАМК и его связь с литием. ответ у пациентов с биполярным расстройством ( 21 ).Хотя эта генетическая ассоциация не была воспроизведена в других клинических образцах ( 22 ), эти результаты вызвали интерес к исследованию in vivo функции и биохимических свойств GADL1. Поскольку цистеинсульфиновая кислота (CSA) является субстратом GADL1, было высказано предположение, что GADL1 участвует в биосинтезе гипотаурина и таурина ( 23 ). Однако также сообщалось, что очищенный человеческий ( 23 ) и мышиный ( 24 ) GADL1 может синтезировать β-аланин из Asp, хотя и с очень низкой скоростью in vitro.Это согласуется с недавними кристаллографическими исследованиями, показывающими, что GADL1 имеет общие структурные особенности как с CSA декарбоксилазой (CSAD), так и с Asp декарбоксилазой ( 25 ). Более того, исследование генетической ассоциации человека продемонстрировало, что однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) в интроне GADL1 прочно связаны с уровнями ацетилкарнозина в крови ( 26 ), которые, в свою очередь, сильно коррелируют с уровнями карнозина ( 2 ). ). На основании этих наблюдений мы предположили, что GADL1 может участвовать в продукции β-аланина и карнозина в тканях млекопитающих.
Здесь мы описываем первую модель мыши с нокаутом Gadl1 (KO) и демонстрируем органоспецифическую роль GADL1 в биосинтезе карнозиновых пептидов и защите от окислительного стресса, особенно в OB и SKM. Чтобы понять субстратную специфичность GADL1, мы сравнили трехмерные (3D) структуры мышиного GADL1 и родственных ферментов. Наконец, мы исследуем связь между общими генетическими вариантами ферментов и переносчиков, участвующих в гомеостазе карнозина, с множеством человеческих черт и заболеваний и представляем начальную поведенческую характеристику мыши Gadl1 KO.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Мыши, лишенные GADL1, демонстрируют возрастные изменения.
Gadl1 – / – (нулевые) мыши были получены с использованием технологии Cre / loxP. Из-за близости гена Gadl1 к гену Tgfbr2 , который кодирует рецептор с возможным влиянием на рост и выживаемость, мы применили консервативную стратегию нокаута, в которой только Gadl1 экзон 7, кодирующий часть PLP -связывающий активный сайт GADL1 был удален (рис.1А). Gadl1 + / + , Gadl1 +/- и Gadl1 – / – мышей были успешно получены в ожидаемых менделевских соотношениях путем скрещивания с Gadl1 +/− мышей. Мы не наблюдали явных физических отклонений. Общая активность и пищевое поведение, а также начальные кривые роста были одинаковыми для всех генотипов. Однако в возрасте 30 недель по сравнению с мышами Gadl1 + / + самки и самцы мышей Gadl1 – / – показали относительную задержку роста, совместимую с возрастными и возможными дегенеративными изменениями (рис.1, Б и В).
Рис. 1. Генерация и характеристика мышей GADL1 KO.( A ) Стратегия нацеливания для выключения экзона (Ex) 7 локуса Gadl1 мыши на хромосоме 9. Gadl1 кодирующие последовательности (заштрихованные прямоугольники), некодирующие части экзона (синий прямоугольник) и последовательности хромосом (оранжевый прямоугольники). Кассета неомицина (нео) -положительной селекции указана между сайтами loxP (синие треугольники) и сайтами-мишенями распознавания Flippase (FRT) (сливовые треугольники).( B и C ) Представлены кривые роста мышей Gadl1 + / + ( n = от 4 до 34) и Gadl1 – / – ( n = от 4 до 40). как среднее ± стандартное отклонение. Различия между генотипами были значительными; P = 0,0008 (64 недели) и P = 0,0005 (70 недель) для мужчин и P = 0,0084 (90 недель) и P = 0,0001 (94 недели) для женщин, соответственно. ( D ) Саузерн-блоттинг-анализ геномной ДНК из Gadl1 + / + и Gadl1 – / – .( E ) Генотипирование потомства от скрещиваний мышей Gadl1 +/- с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Полоса ДНК из 166 пар оснований (п.о.) представляет собой аллель KO (праймер 3), тогда как полосы в 330 п.н. (праймер 2 и 3) и 750 п.о. (праймер 1) являются аллелями дикого типа. ( F ) Репрезентативные вестерн-блоты OB образцов от мышей Gadl1 + / + и Gadl1 – / – (возраст 34 недели, самки) с использованием антитела против GADL1. Положительный контроль представлял собой рекомбинантный His-меченный GADL1 (2 нг; дорожка 1).( G ) Вестерн-блоттинг рекомбинантных усеченных His-меченых Gadl1 + / + и Gadl1 – / – . ( H ) Ферментная активность по отношению к CSA рекомбинантного усеченного His-меченного Gadl1 + / + и Gadl1 – / – ; P <0,001. ( I до K ). Уровни экспрессии РНК (графики вулканов) в ткани OB. (I) Gadl1 + / + -to- Gadl1 +/- отношение, (J) Gadl1 + / + -to- Gadl1 – / – отношение, и ( K) Gadl1 – / – -to- Gadl1 +/- отношение.( L – N ) Количественный анализ ПЦР с обратной транскрипцией (qRT-PCR) нормализованной экспрессии мРНК в тканях OB, мозга, SKM и печени 35-недельной самки Gadl1 + / + (серый ) , Gadl1 +/− (синий) и Gadl1 – / – (красный) мыши для (L) Gadl1 экзонов 7 и 8, (M) Gadl1 экзонов 10 и 11, и (N) CSAD. n = 3 для каждого генотипа. Представлено на шкале Ln y как среднее значение 2 Δ C t и верхний предел (95%).
Секвенирование геномной ДНК и анализ саузерн-блоттинга подтвердили удаление экзона 7 (рис. 1, D и E). Однако количественная оценка мРНК Gadl1 из SKM и OB показала, что некоторые виды мРНК Gadl1 могут быть обнаружены во всех генотипах. Секвенирование РНК показало, что у Gadl1 – / – мышей отсутствовали Gadl1 экзонов 7 и 8. Это было подтверждено с помощью количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (qRT-PCR) отдельных экзонов (см. Ниже).Биоинформатический анализ показал, что делеция экзонов 7 и 8 была связана с созданием нового сайта сплайсинга РНК у мутировавших мышей (рис. S1).
Вестерн-блоттинг подтвердил, что белок GADL1 присутствовал у мышей Gadl1 + / + и Gadl1 +/- , но не у мышей Gadl1 – / – . В OB, выделенном из Gadl1 + / + мышей, GADL1 проявляется в виде широкой полосы с предполагаемой молекулярной массой от 55 до 59 кДа (рис.1F). Это соответствует нескольким предсказанным вариантам белка с 502-550 аминокислотами ( 24 ). Поскольку экзоны 7 и 8 кодируют аминокислоты, участвующие в связывании кофакторов, GADL1, лишенный этих аминокислот, как предполагалось, является ферментативно неактивным. Это было подтверждено экспрессией белка без экзонов 7 и 8 в Escherichia coli и сравнением его с полноразмерным белком (фиг. 1G и фиг. S2). Выход мутантного белка составлял всего 17% по сравнению с выходом полноразмерного белка.Кроме того, мутантный белок полностью лишен ферментативной активности (фиг. 1H). Это продемонстрировало, что устранение функции гена было успешным и что мыши Gadl1 – / – не обладали какой-либо остаточной активностью фермента GADL1.
Удаление
Gadl1 изменяет транскриптом OBЧтобы определить влияние истощения GADL1 на экспрессию генов, мы секвенировали и сравнили уровни мРНК OB из Gadl1 + / + , Gadl1 +/− , и Gadl1 – / – мышей (рис.1, от I до K). Первые 25 генов с повышенной и пониженной регуляцией (log 2 -кратное изменение меньше -1 или больше +1 и P ≤ 0,05) показаны в таблице S1 и на рис. S3. Анализ обогащения пути показал, что наиболее сильно пораженная группа генов участвует в метаболизме лекарств [Киотская энциклопедия генов и геномов (путь KEGG mmu00983; P = 0,00016, q = 0,014] (Таблица 1) ( 27 ). Этот путь включает ген Upb1 (β-уреидопропионаза 1), транскрипт с двукратным увеличением у мышей Gadl1 – / – ( P = 0.0154). UPB1 катализирует последнюю стадию образования β-аланина из пиримидинов. Это согласуется с компенсаторным механизмом поддержания синтеза β-аланина в отсутствие GADL1. Более того, в OB мышей Gadl1 – / – мы наблюдали повышенные уровни транскриптов множества изоформ карбоксилэстеразы 1, цитохрома P450 и миелопероксидазы.
Таблица 1 Анализ обогащения пути, сравнивающий Gadl1 – / – с Gadl1 + / + .Зеленый, повышенный; желтый, с пониженной регулировкой.
Таблица 2 Самцы и самки мышей, использованные в метаболомном исследовании.Анализ пути онтологии генов (GO) ( 27 , 28 ) активируемых или подавляемых генов (log 2 -кратное изменение меньше -1 или больше +1 и P ≤ 0,05) показали статистически значимые изменения в 24 различных биологических процессах, наиболее значимое изменение связано с катаболизмом лекарств (GO: 0042737; P = 2.43 × 10 −7 , q = 0,0007). Кроме того, казалось, что изменились биологические процессы, связанные с циркадными ритмами и циклами сна. Дофаминовые рецепторы (от Drd1 до Drd3 ) и аденозиновый рецептор A2a ( Adora2a ) были наиболее часто повторяющимися генами на протяжении всего анализа GO (таблица S2). Сообщалось, что высвобождение глутамата из окончаний карнозинсодержащих обонятельных нейронов в клубочках OB модифицируется дофаминовыми рецепторами ( 29 ).Возможно, что устранение GADL1 и истощение карнозина также повлияло на экспрессию этих модулирующих рецепторов передатчика в OB. Wu et al. ( 30 ) недавно сообщил, что сверхэкспрессия GADL1 ингибирует экспрессию домена тетрамеризации калиевого канала, содержащего 12 (KCTD12). Однако сравнение мышей Gadl1 – / – и Gadl1 + / + показало, что на уровни РНК KCTD12 не повлияла делеция Gadl1 ( P = 0.62).
Удаление
Gadl1 нарушает метаболизм карнозинаЧтобы изучить биологическую функцию (и) GADL1, мы выполнили метаболомные анализы нецелевой жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ЖХ-МС) восьми различных тканей из 20 Gadl1 + / + мышей и 21 Gadl1 – / – мышей, совпадающих по генотипу и полу (рис. 2). Количество идентифицируемых метаболитов варьировало от 541 до 720 в коре головного мозга, OB, SKM, печени, мозжечке, сердце, сыворотке и почках.Дискриминантный анализ методом наименьших квадратов (PLS-DA) был использован для оценки метаболических различий между Gadl1 + / + и Gadl1 – / – мышами. Это позволило идентифицировать подходящие маркеры, ответственные за метаболические различия, по оценкам переменных важных проекций (VIP).
Рис. 2 Тканеспецифические эффекты на уровни метаболитов у мышей Gadl1 – / – .( A до D ) Наиболее важные характеристики метаболитов на основании баллов VIP> 2 для компонента 1 PLS-DA.Ненаправленное метаболическое профилирование (A) коры головного мозга, (B) OB, (C) SKM и (D) образцов ткани печени из Gadl1 + / + ( n = 20) и Gadl1 – / – ( n = 21) мышей. WT, дикий тип. ( E ) Относительные уровни производных β-аланина и карнозина в тканях мыши Gadl1 + / + (серый) и Gadl1 – / – (красный). н. д., не определена.
Метаболические особенности с оценкой VIP выше 2, ответственные за разделение в каждой ткани, показаны на рис.2 (от A до D). Пептиды карнозина показали наиболее сильную разницу между генотипами в OB и коре головного мозга (рис. 2E). Карнозин также был одним из метаболитов, наиболее сильно влияющих на SKM, но не в печени (рис. 2E). Хотя предполагается, что GADL1 синтезирует ГАМК из глутамата, уровни ГАМК и глутамата у мышей Gadl1, + / + и Gadl1 – / – были одинаковыми во всех исследованных тканях (разница в кратности от 0,88 до 1,15 для глутамат и 0.От 96 до 1,53 для ГАМК; P > 0,05). Gadl1 – / – мышей имели значительно сниженные уровни β-аланина в OB, но несущественное снижение в коре головного мозга и SKM и неизменные уровни в печени. Напротив, карнозин, ацетилкарнозин и ансерин были значительно истощены в тканях мозга и SKM. Незначительное снижение (~ 10%) пептидов β-аланина и карнозина наблюдалось в сыворотке и цельной крови (рис. S4A), а также в почках, мозжечке и сердце.Вместе это согласуется с наблюдаемым распределением GADL1 в тканях и демонстрирует его ключевую роль в метаболическом пути пептидов β-аланина и карнозина.
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса с вращением под магическим углом с высоким разрешением подтверждает истощение карнозина у мышей
Gadl1 – / –Чтобы определить роль GADL1 в содержании карнозина в интактной ткани, мы использовали свежую ткань OB, где мы обнаружили высшее выражение GADL1. Мы выполнили высокоразрешающую спектроскопию вращения под магическим углом (MAS) 1 H – ядерного магнитного резонанса (ЯМР) на OB из Gadl1 + / + ( n = 4), Gadl1 +/− ( n = 3) и Gadl1 – / – ( n = 3) мышей.Характерные особенности карнозина (рис. 3A) можно было идентифицировать в ароматических областях спектра в соответствии с количественной оценкой экстрактов тканей (рис. 3B). По сравнению с Gadl1 + / + , Gadl1 +/- и Gadl1 – / – у мышей было снижено содержание карнозина в ОП на 34 и 70% ( P = 0,0056) (рис. . 3С). Насколько нам известно, это первая демонстрация измерения карнозина в неповрежденной ткани мозга, а также определение спектроскопии ЯМР MAS как быстрого и удобного способа определения карнозина в этой ткани.Кроме того, мы выполнили магнитно-резонансную томографию головного мозга (МРТ) 94-недельной самке мышей Gadl1 + / + , Gadl1 +/- и Gadl1 – / – . Не было значительных различий в морфологии мозга генотипов Gadl1 (рис. 3, с E по F).
Рис. 3 1 H-ЯМР и МРТ тканей мыши и субстратная специфичность GADL1.( A до C ) Измерение карнозина в интактной ткани OB.(А) Химическая структура карнозина. ppm, частей на миллион. (B) MAS 1 H-ЯМР-спектры образцов тканей OB из Gadl1 + / + , Gadl1 +/- и Gadl1 – / – мышей-самцов (12 недель). Два атома водорода имидазольного кольца карнозина обозначены буквами a и b. (C) Относительный интеграл на основе результатов ЯМР, представленный как среднее ± стандартное отклонение. ( D до F ) МРТ головного мозга в (D) Gadl1 + / + , (E) Gadl1 +/- и (F) Gadl1 – / – мышей.Стрелка указывает OB. ( G ) Сравнение химической структуры субстратов GADL1 CSA, Asp и Glu. ( H ) Трехмерные структуры подложки, демонстрирующие различия в размере и форме Glu по сравнению с CSA и Asp. ( I ) Активные сайты GADL1, GAD и CSAD и предсказанный способ связывания Glu с GAD. Прогноз основан на комплексе между GAD и ингибитором хелидоновой кислоты ( 63 ).
Субстратная специфичность GADL1
Многие PLP-зависимые ферменты имеют несколько субстратов ( 31 ).Чтобы выяснить, могут ли дивергентные метаболические изменения, наблюдаемые у мышей Gadl1, , – / – , быть вторичными по отношению к изменениям уровней β-аланина, или они связаны с параллельным химическим превращением нескольких субстратов с помощью GADL1, мы решили кристаллическую структуру GADL1 мыши. ( 25 ). Структура тесно связанного CSAD была решена ранее, но не опубликована [запись 2JIS из банка данных белка (PDB)]. Имея доступные кристаллические структуры GADL1, CSAD и GAD ( 32 ), можно идентифицировать детерминанты субстратной специфичности этих кислых декарбоксилаз аминокислот.GADL1 и CSAD имеют разные, хотя и немного перекрывающиеся, физиологические функции ( 24 ). GADL1 через превращение Asp в β-аланин играет важную роль в биосинтезе карнозинового пептида, в то время как CSAD катализирует основной путь синтеза таурина, используя CSA в качестве субстрата. Несмотря на схожую химическую структуру двух субстратов (рис. 3G), эти два очень похожих фермента могут различать их. И Asp, и CSA меньше Glu (рис. 3H), что объясняет неспособность GADL1 и CSAD функционировать как глутаматдекарбоксилазы (рис.3I). Карбоксильная группа в Asp плоская, в то время как фрагмент сульфиновой кислоты в CSA является тетраэдрическим и имеет несколько более длинные связи; эффективно, CSA немного больше и, возможно, может более конкретно приспосабливаться к сайту связывания из-за своей формы и заряда.
Поскольку химическая реакция, катализируемая ферментами, идентична, мы можем предположить, что реактивные группы связываются идентичным образом, а различия заключаются в распознавании боковой цепи субстрата. GAD использует Glu в качестве субстрата, в то время как GADL1 действует на Asp, что указывает на то, что длина боковой цепи является одним из факторов, определяющих продуктивное связывание.Для связывания отрицательно заряженной боковой цепи в кармане специфичности ожидается обнаружение потенциала положительного заряда в форме аминогрупп. Для GAD эти взаимодействия можно представить; две группы NH основной цепи и молекула воды, координируемая консервативным остатком His, координируют карбоксильную группу боковой цепи в модели субстратного комплекса вместе с боковой цепью Ser. Чем отличается GADL1? Основное различие заключается в замене этого Ser на остаток Tyr (рис. 3I), эффективно уменьшая полость связывания.Взаимодействия с пептидным остовом и единицей His-вода, вероятно, законсервированы для связывания Asp с GADL1. Карман специфичности содержит остаток Tyr (GADL1) или Phe (CSAD), и несколько различных конформаций этих остатков достаточно, чтобы вызвать эту разницу в специфичности субстрата.
Тканеспецифические эффекты GADL1 на синтез таурина и его производных
На основании способности очищенного GADL1 продуцировать гипотаурин из CSA было высказано предположение, что основная биологическая функция GADL1 может заключаться в синтезе таурина ( 23 ).Однако концентрации субстратов и продуктов синтеза таурина не изменились у мышей Gadl1 – / – в головном мозге, OB и печени. Напротив, уровни производных таурина были умеренно снижены в SKM в Gadl1 – / – (рис. S4). Это согласуется с наблюдениями, что таурин в основном синтезируется другими путями, такими как CSAD ( 33 ), и нашим предыдущим выводом о том, что CSAD экспрессируется в небольших количествах в SKM ( 24 ).Сообщается, что во всех исследованных тканях белок CSAD более распространен, чем GADL1, а очищенный CSAD имеет константу специфичности декарбоксилирования CSA в 5–35 раз выше, чем GADL1 ( 24 ). Более того, как показано здесь, анализ qRT-PCR показал, что уровни мРНК Csad были по крайней мере в 10 раз выше, чем уровни Gadl1 , и на них не повлияла делеция экзонов Gadl1 (рис. 2N). Таким образом, мы заключаем, что в органах с высоким содержанием CSAD GADL1 играет второстепенную роль в синтезе таурина.В отсутствие CSAD уровни таурина в плазме, печени и головном мозге мышей снизились на 70-90%, при этом наибольшее снижение произошло в печени, а наименьшее – в головном мозге ( 33 ). Эта оставшаяся биосинтетическая способность таурина была приписана альтернативному пути биосинтеза таурина, катализируемому цистеаминдиоксигеназой из цистеамина, генерируемого из кофермента A ( 34 ). Однако наши результаты показывают, что GADL1 обладает небольшой способностью к биосинтезу таурина in vivo, что может способствовать общему производству таурина.
Маркеры окислительного стресса
Несколько линий доказательств подтверждают роль карнозиновых пептидов в защите от окислительного стресса ( 1 , 35 ). Чтобы изучить роль GADL1 в антиоксидантной защите, мы сравнили уровни маркеров окислительного стресса у мышей Gadl1 + / + и Gadl1 – / – . Gadl1 – / – мышей имели повышенные уровни маркеров окислительного стресса, включая сульфоксид метионина и γ-глутамилпептиды.Эти изменения совместимы с повышенным синтезом глутатиона и соответствуют повышенному окислительному стрессу. Некоторые маркеры окислительного стресса сильно увеличивались даже в тканях с умеренным снижением карнозиновых пептидов, таких как печень. Мы также сравнили тканевые уровни антиоксидантных ферментов супероксиддисмутазы 1 (SOD1) (CuZnSOD), SOD2 (MnSOD) и глутатионредуктазы (GSR) у мышей Gadl1 + / + и Gadl1 – / – ( OB, кора головного мозга и SKM) с помощью вестерн-блоттинга (рис.4). Неожиданно наиболее очевидная разница была обнаружена в OB, где у мышей Gadl1 – / – было трехкратное увеличение уровней GSR ( P = 0,0145) (рис. 4A).
Рис. 4 Относительные уровни антиоксидантных ферментов в тканях мышей Gadl1 – / – .( A до E ) Репрезентативные вестерн-блоты (B, D и F) и нормализованные уровни экспрессии белка. (A), (C) и (E) для GSR, SOD1 (CuZnSOD) и SOD2 (Mn) в (A и B) OB, (C и D) коре головного мозга и (E и F) ткани SKM из самки Gadl1 + / + и Gadl1 – / – мышей.
В отличие от карнозина и ансерина, которые были снижены во многих тканях, уровни гомокарнозина были значительно увеличены в OB мышей Gadl1 – / – (рис. 2E). Некоторые другие метаболиты, связанные с синтезом β-аланина, также были изменены (рис. S4, G, I и J).
Gadl1 – / – у мышей также были повышены уровни многих видов липидов, включая сфинголипиды, с наиболее сильными эффектами в OB (рис. 2, A – D и рис. S4K).Примечательно, что сложные сфинголипиды накапливаются при воспалении и окислительном стрессе, условиях, к которым мыши Gadl1 – / – кажутся более восприимчивыми. Более того, сфинголипиды могут изменять сократимость мышц ( 36 ).
Поведение животных и морфология тканей
Чтобы изучить влияние делеции Gadl1 на функцию мозга, мы протестировали ряд моделей поведения мышей на Gadl1 + / + ( n = 13) и Gadl1 – / – ( n = 13) 22-недельных самцов мышей.В открытом поле латентность первого входа в центр значительно различалась для разных генотипов: Gadl1 – / – мышей требовалось меньше времени для входа в центр (рис. 5, от A до E). Однако совокупное время, проведенное в центре открытого поля, не было значимым между группами, равно как и показатели теста приподнятого крестообразного лабиринта и постоянного злоумышленника. Только разница в латентности атаки между первоначальным тестированием и повторным тестированием через день значительно различалась между генотипами.Оба генотипа показали значительное предпочтение социального цилиндра по сравнению с несоциальным в трехкамерном задании ( P <0,0001), но между генотипами не было значительной разницы. Исходя из этого, кажется, что снижение содержания карнозина в ОМ мыши (~ 70%) и коре головного мозга (~ 40%) может привести к тому, что у мышей Gadl1 – / – появится повышенная инициация входа в открытую зону. (что свидетельствует о снижении тревожности). Однако это должно быть смягчено наблюдением, что общее время, проведенное в центре открытого лабиринта, равно как и разница в соотношении времени, проведенного на закрытых и открытых рукавах приподнятого крестообразного лабиринта.Целесообразно дальнейшее исследование любого возможного анксиолитического эффекта мышей Gadl1 – / – .
Рис. 5 Поведенческие фенотипы, ассоциированные с Gadl1 – / – мышей, гомеостаз карнозина и фенотипы человека.( A ) Трехкамерная задача: время, проведенное в каждом цилиндре, не отличалось между генотипами. Обе мыши Gadl1 + / + и Gadl1 – / – предпочитают социальный цилиндр, что указывает на то, что общительность остается схожей.( B ) Задача «Открытое поле»: совокупное время, проведенное в центре, не отличалось между генотипами. По этому показателю успокаивающего эффекта не наблюдалось. Однако в латентном периоде для входа в центр (еще один показатель тревожности) Gadl1 – / – быстрее входил в центр, что может указывать на некоторые анксиолитические эффекты фенотипа Gadl1 – / – , которые потребовали бы подтверждение в дополнительных исследованиях. ( C ) Задача открытого поля: скорость исследования не различалась между генотипами, что указывает на отсутствие влияния на двигательную функцию.Аналогичные наблюдения были сделаны с данными об общем пройденном расстоянии. В совокупности это предполагает отсутствие влияния генотипа на показатели активности. ( D ) Приподнятый крестообразный лабиринт: было обнаружено, что соотношение времени, проведенного (а) на открытых и закрытых рукавах, не различается между генотипами. Оба генотипа предпочитают закрытую (защищенную руку), что свидетельствует об отсутствии разницы в тревожности по этому показателю. ( E ) Парадигма резидентного злоумышленника: латентность атаки против злоумышленника с первого по пятый день (тесты с 1 по 5) не различалась между генотипами.Оба генотипа атакуют быстрее на второй день по сравнению с первым днем, после которого латентность атаки остается постоянной. Это говорит об отсутствии влияния генотипа на агрессию. ( F ) Краткий обзор различных путей с участием β-аланина. Гены, проанализированные в этом исследовании, отмечены синим цветом. ( G ) Анализ ассоциации генов, участвующих в метаболизме карнозина. Звездочка указывает на статистическую значимость после поправки на множественное тестирование. СДВГ, синдром дефицита внимания с гиперактивностью; БАС, боковой амиотрофический склероз; SWB, субъективное благополучие; AMD, возрастная дегенерация желтого пятна; UACR – отношение альбумина к креатинину в моче; NA, не применимо.
Чтобы изучить влияние делеции Gadl1 на старение и морфологию органов, мы сравнили срезы тканей 33 мышей в возрасте от 28 до 96 недель, одинаково сопоставимых для разных полов и генотипов. На микроскопическом уровне элиминация Gadl1 не повлияла на морфологию SKM, головного мозга и OB (рис. S5A).
Общие генетические варианты в локусе
GADL1 связаны с множественными фенотипами человека Исследования GWA(GWAS) показали ассоциации локуса GADL1 с множеством человеческих черт и заболеваний, включая расстройства пищевого поведения ( 37 ), почки функции ( 38 ) и несколько метаболитов в крови.Это включает сильную ассоциацию с уровнями ацетилкарнозина ( P = 8,17 × 10 −21 ) в локусе GADL1 в межгенном SNP rs6804368 (13,9 т.п.н. из GADL1 и 17,9 т.п.н. из TGFBR214 ) ( TGFBR214 ) 26 ). О самой сильной ассоциации ( P = 5,50 × 10 −37 ) сообщалось для ответа на литий (Li + ) при биполярном расстройстве по SNP (rs17026688), расположенному в интроне 6 GADL1 ( 21 ).Однако эти результаты не были воспроизведены в других клинических образцах ( 24 ).
Чтобы получить обзор генетических ассоциаций между фенотипами человека и ферментами в метаболизме карнозина, мы провели генные тесты с использованием программного обеспечения MAGMA ( 39 ), в основном сосредоточив внимание на чертах, связанных с окислительной защитой и функциями мозга. Мы включили ассоциации общих вариантов в GADL1 и семь родственных генов (рис. 5) ( 40 ). Мы ограничили поиск 21 фенотипом с общедоступной сводной статистикой GWAS, полученной на больших выборках (общее количество тестов 167; скорректированный Бонферрони P порог значения = 2.99 × 10 −4 ). Таблица S3 показывает обзор использованных данных.
GADL1 был связан с уровнями ацетилкарнозина в сыворотке ( P = 1,25 × 10 −11 ), функцией почек ( P = 1,03 × 10 −7 ) и субъективным благополучием ( P = 1,22 × 10 −4 ). CARNMT1 был связан с индексом массы тела ( P = 1,12 × 10 −4 ). CARNS1 был связан с силой правого хвата (мышечной силой) ( P = 4.98 × 10 −5 ). SLC15A2 был связан с функцией почек ( P = 8,60 × 10 −12 ). Кроме того, несколько предварительных ассоциаций ген-фенотип не прошли скорректированный по Бонферрони порог значимости. В заключение, из восьми протестированных генов, которые, как известно, участвуют в метаболизме карнозина, GADL1 и SLC15A2 показали наиболее сильную связь с фенотипами человека. Наиболее очевидные ассоциации наблюдались для уровней ацетилкарнозина, силы мышц, функции почек и общего самочувствия, но не для ряда нейропсихиатрических заболеваний, которые, как сообщалось, поддаются лечению карнозином (рис.5, G и F) ( 14 ).
ОБСУЖДЕНИЕ
Карнозиновые пептиды были обнаружены в 1900 году, однако их биологические функции и пути биосинтеза все еще обсуждаются ( 1 ). Здесь мы сообщаем о первой модели животных, лишенной GADL1. Мы показываем, что у этих животных низкие уровни пептидов β-аланина и карнозина, что согласуется с ключевой ролью GADL1 в их синтезе. Этот фермент аналогичен декарбоксилазам Asp, ранее обнаруживаемым только у прокариот и насекомых ( 23 ).
Пептиды карнозина, за исключением гомокарнозина, были значительно истощены в головном мозге и SKM. Напротив, снижение было умеренным и незначительным во многих других тканях, включая почки, сердце, цельную кровь и сыворотку. Кроме того, уровень β-аланина был значительно снижен только в OB. Поскольку активность GADL1 была устранена у Gadl1 – / – мышей, оставшийся β-аланин и его пептидные производные могут быть получены либо из рациона, кишечными бактериями, передаваемыми по материнской линии от гетерозиготных матерей, используемых для разведения, либо de novo. синтез.Биохимический анализ стандартной растительной диеты для грызунов подтвердил низкие уровни β-аланина и карнозина, но мы не можем исключить возможный небольшой вклад в рацион β-аланина, пантотеновой кислоты (витамин B5) или пептидов карнозина (таблица S4). Однако более вероятно, что существует несколько альтернативных путей биосинтеза β-аланина, и что они играют разные роли в разных тканях. Таким образом, в тканях с наивысшими требованиями к синтезу карнозина, т. Е. В SKM, головном мозге и особенно в OB, мы демонстрируем критическую роль биосинтеза de novo β-аланина в поддержании его уровней, а также в компенсаторном повышении регуляции задействованных ферментов. альтернативными биосинтетическими путями.Поскольку уровень β-аланина и карнозиновых пептидов в крови умеренно зависит от устранения GADL1, кажется, что мышцы и мозг в меньшей степени зависят от поглощения этих соединений из кровотока.
Альтернативные пути биосинтеза могут включать синтез β-аланина с помощью CSAD, который имеет относительно низкую удельную синтетическую активность β-аланина, но гораздо более высокое содержание в тканях, чем GADL1 ( 24 ), производство β-аланина из урацила с помощью уреидопропионазы 1 [β -аланинсинтаза, UPB1; N -карбамоил-β-аланинамидогидролаза; (BUP1 / UPB1)] ( 41 ) или другими ферментами, такими как β-аланин-2-оксоглутараттрансаминаза (ABAT) или β-аланинпируваттрансаминаза (AGXT2) ( 20 ).Наши результаты контрастируют с более ранними наблюдениями, которые не обнаружили декарбоксилирования Asp в мышцах крысы ( 23 ). Добавка PLP с пищей значительно увеличивает концентрацию пептидов β-аланина и карнозина в SKM крыс ( 20 ). Поскольку GADL1 зависит от PLP, это увеличение может быть связано с активацией GADL1 с помощью PLP. Напротив, PLP не требуется для продукции β-аланина UPB1. Наше наблюдение повышенных уровней транскрипта Upb1 в OB мышей Gadl1, – / – , но неизмененные уровни Abat и Agxt2 указывают на роль UPB1 в поддержании уровней β-аланина.Однако это открытие противоречит более ранним наблюдениям белка UPB1 в печени и почках крыс, но не в мозге, легких, SKM или селезенке ( 41 ).
В отличие от пониженных уровней β-аланина, карнозина, ансерина и ацетилкарнозина, уровни гомокарнозина были увеличены. Вероятно, это результат нехватки предшественника β-аланина и карнозиновых пептидов, что указывает на то, что уровни этих дипептидов в тканях могут жестко регулироваться. Более того, не было обнаружено существенной разницы в ГАМК между Gadl1 + / + и Gadl1 – / – мышами.Вместе с наблюдениями повышенного уровня гомокарнозина (пептида, производного от ГАМК), это указывает на то, что GADL1, несмотря на свое название, не катализирует декарбоксилирование глутамата до ГАМК. На рисунке 5F суммированы различные пути биосинтеза карнозиновых пептидов, а также основные ферменты и переносчики, которые, как полагают, участвуют в этом метаболизме в тканях млекопитающих.
Поскольку локус Gadl1 на хромосоме 3p24.1-3p23 близок к локусу Tgfbr2 (3p24.1), и генетические варианты в непосредственной близости от Gadl1 влияют на уровни трансформирующего фактора роста-β в плазме (TGF- β) рецептора типа 2 (TGFBR2), стратегия нацеливания на ген была разработана таким образом, чтобы избежать регуляторных последовательностей в этой области.Эта стратегия привела к экспрессии небольших количеств каталитически неактивной и нестабильной частично усеченной версии белка GADL1, но транскриптов Tgfbr2 остались неизменными.
Для определения субстратной специфичности GADL1 мы ранее экспрессировали фермент мыши в бактериях и проверили очищенный GADL1 против всех протеиногенных аминокислот, а также многих других предполагаемых субстратов и ингибиторов, демонстрируя активность декарбоксилазы против Asp, CSA и цистеина ( 24 ).Этот профиль подложки был аналогичен профилю Liu et al. ( 23 ) наблюдали для человеческого фермента. Однако по сравнению с другими PLP-зависимыми декарбоксилазами сродство и селективность были очень низкими для всех протестированных субстратов. Лю и др. ( 23 ) сообщил, что невозможно обнаружить активность фермента GADL1 в тканевых лизатах. Здесь мы показываем, что, несмотря на чрезвычайно низкую активность in vitro, GADL1 важен для синтеза пептидов β-аланина и карнозина, особенно в OB, коре головного мозга и SKM.
Gadl1 – / – у мышей также были снижены уровни таурина и множественных производных таурина в SKM, что указывает на то, что CSA также является физиологически значимым субстратом. Gadl1 – / – мышей также показали другие биохимические изменения, которые могут быть вторичными по отношению к истощению производных β-аланина и антиоксидантной функции или другим эффектам инактивации GADL1. Gadl1 делеция может изменять энергетический метаболизм несколькими путями. Помимо своей роли в синтезе карнозина, β-аланин является компонентом пантотеновой кислоты (витамина B5) и кофермента A, важного кофактора для множества биохимических путей, включая энергетический метаболизм.
Роль GADL1 как относительно неспецифической декарбоксилазы низкомолекулярных кислотных субстратов согласуется с его относительно высокими значениями константы Михаэлиса-Ментен ( K m ) и низкой каталитической эффективностью ( 24 ). Геномы млекопитающих кодируют сотни PLP-зависимых ферментов, многие из которых могут катализировать новые или неклассифицированные реакции ( 31 ). Кроме того, из-за их общих механистических свойств и схожих структур многие PLP-зависимые ферменты могут катализировать множество биохимических реакций.Эта неразборчивость затрудняет определение их основных биологических функций ( 31 ). У некоторых ферментов появилось несколько физиологических субстратов. Такая реакционная способность с несколькими субстратами может быть полезной для пригодности ( 42 ). GADL1 может быть примером фермента с множественной биологической активностью. Хотя наиболее сильным эффектом делеции GADL1, по-видимому, было уменьшение пептидов β-аланина и карнозина при сохранении тауринового пути, у мышей Gadl1 – / – также было немного снижено количество производных таурина в SKM, что согласуется с множественные каталитические функции этого фермента.Точно так же, хотя накопление биомаркеров окислительного стресса у Gadl1 – / – мышей, вероятно, является вторичным по отношению к потере пептидов β-аланина или карнозина, мы не можем исключить, что метаболические изменения могут быть вызваны другими функциями GADL1.
Исследование каталитического сайта GADL1 мыши показывает, что он может быть доступен для различных небольших, кислых, полярных субстратов. Из сравнения (рис. 3I) можно заметить, что очень незначительные изменения в аминокислотах, определяющих специфичность, в непосредственной близости от активного сайта могут определять функцию фермента на уровне ткани и организма.Эти структурные особенности хорошо соответствуют ранее сообщенной субстратной специфичности очищенного GADL1 мыши и человека ( 23 – 25 ). Для более детального понимания каталитических свойств GADL1, а также его ближайших гомологов, потребуются структурные исследования с высоким разрешением с лигандами активного центра, предпочтительно с видимой гибкой каталитической петлей.
Эксперименты как in vitro, так и in vivo показали, что активные формы кислорода могут снижать уровни антиоксидантных ферментов, таких как SOD и глутатионпероксидаза, и что добавление карнозина может восстанавливать истощенные уровни этих ферментов ( 1 ).Пептиды карнозина считаются важными для защиты, например, от повреждения свободными радикалами, связанного с ишемией ( 1 ). Однако защитная функция карнозина изучалась только in vitro или на животных, получавших большие фармакологические дозы карнозина. Таким образом, пищевые добавки с β-аланином и карнозином широко используются людьми и продаются для защиты от окислительного стресса ( 1 ). Однако сообщалось о противоречивых результатах, и было отмечено, что повышенные уровни β-аланина снижают клеточные уровни таурина и связаны с повышенным окислительным стрессом ( 43 ) и изменением энергетического метаболизма ( 44 ).Здесь мы показываем, что мыши с делецией Gadl1 имеют повышенные уровни биомаркеров окислительного стресса и измененные уровни некоторых антиоксидантных ферментов. Эти результаты подтверждают, что эта модель на мышах является новым инструментом для изучения не только синтеза β-аланина, но также биологии карнозинового пептида и их связи с окислительным стрессом и заболеваниями.
Делеция дипептидного переносчика карнозина мыши Pept2 (SLC15A) , как сообщалось ранее, изменяет уровни карнозина в нескольких органах, но не так заметно, как у мышей Gadl1 – / – ( 45 ).Эти органоспецифические эффекты указывают на то, что, хотя пептиды β-аланина и карнозина в основном синтезируются локально в OB, другие органы в основном поглощают пептиды карнозина и их предшественники из кровотока. Гомеостаз карнозина в SKM регулируется множеством пищевых и гормональных стимулов в сложном взаимодействии между транспортерами и ферментами, включая CARNS , CNDP2 , PHT1 , PHT2 , TauT ,
Поскольку Gadl1 – / – мышей демонстрировали поведенческие изменения, а пептиды β-аланина и карнозина участвовали во многих различных физиологических функциях и болезненных состояниях, мы выполнили генный анализ GADL1 и непосредственно ферментов и переносчиков. участвует в метаболизме карнозина.Мы выбрали 21 человеческое заболевание и признак, связанный с окислительным стрессом, и лечение карнозиновыми пептидами показало некоторые многообещающие эффекты (рис. 5G) ( 12 , 48 ). Помимо сильной ассоциации с уровнями карнозинового пептида в плазме, общие варианты в локусе GADL1 были связаны с субъективным благополучием и мышечной силой. Связь с субъективным благополучием особенно интригует. Этот фенотип генетически связан с соматическими жалобами не только в виде телесных болей и болей, но также и с низкой энергией, тревогой и депрессией – чертами, которые, как было показано в исследованиях на животных, связаны с уровнями карнозиновых пептидов в головном мозге и SKM () 49 ).Однако для большинства изученных заболеваний мы не наблюдали значимых ассоциаций с генами, связанными с гомеостазом карнозина. Тем не менее, мы не можем исключить возможные эффекты редких генетических вариантов или роль в других группах пациентов или популяциях. Поведенческие данные мышей Gadl1 – / – предполагают, что связь между GADL1 и тревогой заслуживает дальнейшего изучения, включая изучение различий в сенсорной обработке и изменений в поведении, связанном со страхом.
Метаболомика мозга выявила большие региональные различия с особенно большими градиентами концентрации карнозина ( 50 ). Однако до сих пор остается загадкой, почему GADL1 и его пептидные продукты карнозина так распространены в OB. У рыбок данио высокая иммунореактивность в отношении карнозина и ансерина обнаружена в сенсорных нейронах и несенсорных клетках обонятельного эпителия, обонятельного нерва и OB, что указывает на специфическую роль этих пептидов в органах чувств ( 51 ).На основании раннего появления карнозиновых пептидов во время эмбрионального развития было высказано предположение, что эти пептиды играют роль в развивающейся нервной системе, в частности, в обонятельной и зрительной функциях ( 51 ). Наши данные об интактной гистологической архитектуре и умеренных поведенческих эффектах делеции Gadl1 могут опровергать эту гипотезу. Однако также возможно, что оставшиеся 10-30% карнозиновых пептидов являются адекватными для поддержания этих биологических эффектов, как сообщается для других нейротрофических факторов, таких как серотонин ( 52 ).В качестве альтернативы возможна нейрозащитная, антиоксидантная роль пептидов GADL1 и карнозина. Обонятельный эпителий обеспечивает прямой путь поступления веществ из окружающей среды в OB и мозг для веществ, которые могут вызвать окислительный стресс. Эти вещества могут вызывать возрастную клеточную дегенерацию и повреждение обоняния, и предотвращение этого повреждения зависит от исправной системы антиоксидантной защиты. Хотя исходные уровни GADL1 низкие, уровни этого фермента могут повышаться в ответ на окислительное повреждение и другие физиологические стрессоры, как показано в олигодендроцитах, полученных на мышиной модели бокового амиотрофического склероза ( 53 ), и в SKM при физических нагрузках ( 46 ).
ВЫВОДЫ
GADL1 необходим для продукции пептидов β-аланина и карнозина, особенно в головном мозге и SKM. У мышей, лишенных GADL1, наблюдаются изменения в поведении, повышенные маркеры окислительного стресса и возрастные изменения, что подчеркивает биологическое значение этих пептидов. Общие варианты в локусе GADL1 человека связаны с плазменными уровнями ацетилкарнозина, мышечной силой, функцией почек и субъективным благополучием. В будущих исследованиях следует изучить, как этот фермент регулируется и его участие в физиологических функциях, включая механизмы антиоксидантной защиты, и патологические состояния.
МАТЕРИАЛЫ
Химические вещества, включенные в данное исследование, были приобретены у Sigma-Aldrich, если не указано иное. Зонды для qRT-PCR были от Thermo Fisher Scientific, используемые наборы были от Thermo Fisher Scientific или QIAGEN, агароза была от Apollo Scientific, а гели для электрофореза в SDS-полиакриламидном геле (PAGE) были от Bio-Rad. O -Фталевый диальдегидный реагент и 2-меркаптоэтанол были от Merck Schuchardt. Нитрат 1-карнозина использовали в качестве стандарта для ЯМР-спектроскопии.
МЕТОДЫ
Этическое заявление
Это исследование проводилось в соответствии с норвежскими законами и постановлениями и Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях. Протокол был одобрен Комитетом по исследованиям на животных Норвежского агентства по безопасности пищевых продуктов (Mattilsynet, номер разрешения 9468).
Получение
Gadl1 -нулевых мышейGadl1 -нулевых (-) мышей получали путем гомологичной рекомбинации у мышей C57BL / 6N в genOway, Лион, Франция.На основе последовательности комплементарной ДНК (кДНК) Gadl1 NM_028638 была установлена экзонная / интронная организация гена. Ген мыши Gadl1 расположен на хромосоме 9 и простирается на более чем 183,6 пар оснований (kbp) (карта последовательности Chr9: 115
Разведение
Гетерозиготных братьев и сестер было произведено Gadl1 – / – гомозиготных детенышей. Дальнейшее разведение и генотипирование проводились в зоопарке Университета Бергена (Берген, Норвегия). Животных помещали в группы в виварии с контролируемой температурой и светом (21 ° ± 1 ° C; 12: 12-часовой искусственный циркадный ритм свет / темнота). Все эксперименты проводились на мышах обоего пола в возрасте от 3 до 96 недель, которых кормили ad libitum, используя стандартные диеты для грызунов [крыса и мышь №.1 (RM1)] во время содержания и RM3 во время разведения (Scanbur / Special Diets Services, Witham, UK). Эти диеты основаны на растениях. Указано содержание природных аминокислот, но не указано содержание карнозиновых пептидов (http://sdsdiets.com/pdfs/RM1-A-P.pdf). Дальнейший анализ показан в таблице S4.
Gadl1 Определение генотипа мышиДНК экстрагировали из образцов ушей мышей в возрасте 2 недель. Генотипирование выполняли с использованием набора для мультиплексной ПЦР (№206143, QIAGEN).После начальной тепловой активации при 94 ° C в течение 15 минут ДНК денатурировали при 94 ° C в течение 30 с, отжигали при 60 ° C в течение 1,30 мин и растягивали при 72 ° C в течение 1,30 мин. Этот цикл повторяли 25 раз. ДНК продлили еще на 30 минут после последнего цикла. Продукты ПЦР анализировали с помощью электрофореза в 2% агарозном геле. Размер продукта ПЦР составлял 166 п.н. у мышей Gadl1 – / – и 330 и 750 п.н. у мышей Gadl1 + / + . Размеры всех трех пар оснований были измерены у мышей Gadl1 +/- (166, 330 и 750 п.н.).Размеры продуктов ПЦР и последовательности праймеров приведены в таблице S5 и на фиг. 1E.
Проверка модели животных
Стратегия удаления была проверена с использованием секвенирования ДНК, секвенирования РНК, протеомного анализа и вестерн-блоттинга. Секвенирование ДНК подтвердило отсутствие экзона 7 в геномной ДНК мышей Gadl1 – / – . Мы определили баллы ветвления, которые отражают способность каждого экзона к сплайсингу, используя инструмент прогнозирования сплайсинга РНК SROOGLE ( 54 ).Это дало более низкую оценку сплайсинга для экзона 8 по сравнению с экзоном 9, предполагая, что сплайсинг экзона 6 с экзоном 9 был предпочтительнее сплайсинга с экзоном 8. Данные qRT-PCR также предполагали, что мРНК Gadl1 из Gadl1 – / – мышей оказались стабильными. Однако анализ последовательности показал, что оба экзона 7 и 8 отсутствовали в мРНК Gadl1 у мышей Gadl1 – / – . Ожидается, что мРНК, лишенная экзонов 7 и 8, будет стабильной и продуцирует усеченный белок.Экспрессию и очистку белка GADL1 мыши в E. coli выполняли, как описано (фиг. S2) ( 24 ). Сайт-направленный мутагенез мышиного GADL1 для генерации белка, лишенного экзонов 7 и 8 (кодирующая последовательность белка, NHPRFFNQLYAGLDYYSLAARIITEALNPSIYTYEVSPVFLLVEEAVLKKMIECVGWKEGDGIFNP), выполняли с использованием следующих праймеров: TTTTTGWKEGDGIFNP: (вперед), 5′-AGAAAGCACCGCCGGCTCCT-3 ‘(вперед), 5′-GGATGAGATAGACAGCCTGG-3′ (вперед), 5’-TTTCTGTTCATGGGGGTAAT-3 ‘(вперед), 5′-TGCGGTATTCGGAATCT (назад), 5’-TGCGGTATTCGGAATCT (назад), -ACGCATCGTGGCCGGCATCA-3 ‘(обратный), 5′-CGATTTCGGCCTATTGGTTA-3′ (прямой), 5’-TGCACAATCTTCTCGCGCAA-3 ‘(обратный), 5′-ATGGG CTACGATCATGTAACTCG-3’ -3 ‘-3′ -3) обратный), 5’-CGGATCAAGAGCTACCAACT-3 ‘(вперед), 5′-TAACGAAGCGCTGGCATTGA-3′ (обратный) и 5’-GCCTTTGAGTGAGCTGATAC-3 ‘(вперед).
Метаболомические исследования с использованием LC-MS
Животных анестезировали уретаном (250 мг / мл), вводимым внутрибрюшинно, и доводили до их индивидуального веса (от 1,4 до 1,8 мг / кг). Ткани перфузировали 50 мл 0,02% физиологического раствора гепарина, прокачанного через левый желудочек сердца, перед извлечением органа. После вскрытия ткани мгновенно замораживали в жидком азоте и хранили при -80 ° C до использования. В общей сложности 172 различных образца тканей от 41 животного были отправлены в компанию Metabolon Inc. при температуре −80 ° C.(Дарем, Северная Каролина, США) для дальнейшей обработки. Самцов и самок мышей подбирали по генотипу и возрасту. В таблице 2 показан список мышей, использованных в метаболомном исследовании.
Все 41 животное были проанализированы на метаболиты мозга, SKM и печени. Подгруппа из 21 животного (10 Gadl1 + / + и 11 Gadl1 – / – , 4,63 и 4,89 недели соответственно) была проанализирована на метаболиты OB. Исследовательские анализы были выполнены в почках, мозжечке, сердце, цельной крови и сыворотке 12-недельных мужчин (семь Gadl1 + / + и семь Gadl1 – / – ).Из-за ограниченных возможностей животноводческого комплекса образцы были препарированы и отправлены тремя отдельными партиями с тканями из 10 (5 Gadl1 + / + и 5 Gadl1 – / – ) , 17 ( 8 Gadl1 + / + и 9 Gadl1 – / – ) и 14 (7 Gadl1 + / + и 7 Gadl1 – / – ) животных, соответственно. Все образцы обрабатывались с использованием идентичного конвейера.
В компании Metabolon образцы готовили с использованием автоматизированной системы Microlab STAR® от компании Hamilton. Для удаления белка, диссоциации небольших молекул, связанных с белком или захваченных в осажденной белковой матрице, и для восстановления химически различных метаболитов белки осаждали метанолом при энергичном встряхивании в течение 2 минут (Glen Mills Geno / Grinder 2000) с последующим центрифугированием. Полученный экстракт был разделен на четыре фракции для анализа с использованием различных хроматографических методов.Экстракт каждого образца хранили в течение ночи в атмосфере азота перед подготовкой к анализу. После этого образцы были восстановлены в соответствующих растворителях (в соответствии с хроматографическим методом) и содержали серию стандартов с фиксированными концентрациями для обеспечения впрыска и хроматографической согласованности.
Метаболомические анализы проводились с помощью трех использованных хроматографических методов, основанных на обращенно-фазовой / сверхэффективной жидкостной хроматографии (UPLC) -MS / MS-хроматографии с ионизацией электрораспылением (ESI) в режиме положительных и отрицательных ионов и одним хроматографическим методом с использованием жидкостной хроматографии с гидрофильным взаимодействием. / UPLC-MS / MS с режимом отрицательных ионов ESI.Используемые колонки представляли собой Waters UPLC BEH C18 (2,1 мм на 100 мм, 1,7 мкм) и Waters UPLC BEH Amide (2,1 мм на 150 мм, 1,7 мкм).
Метаболомические анализы выполняли в UPLC (Waters ACQUITY), подключенном к масс-спектрометру высокого разрешения / точности Thermo Fisher Scientific Q Exactive, сопряженному с подогреваемым источником ESI (HESI-II) и масс-анализатором Orbitrap, работающим с разрешением по массе 35000. Анализ MS чередовался между сканированием MS и MS n с использованием динамического исключения. Диапазон сканирования варьировался между методами, но охватывал соотношение масса / заряд от 70 до 1000 ( m / z ).
Соединения были идентифицированы путем сравнения с записями в библиотеке очищенных стандартов или повторяющихся неизвестных объектов. Metabolon поддерживает библиотеку, основанную на проверенных стандартах, которые содержат время / индекс удерживания (RI), m / z , и хроматографические данные (включая спектральные данные МС / МС) для всех молекул, присутствующих в библиотеке. Кроме того, биохимическая идентификация основана на трех критериях: индекс удерживания в пределах узкого окна RI предлагаемой идентификации, точное соответствие массы библиотеке ± 10 частей на миллион, а также прямые и обратные оценки MS / MS между экспериментальными данными и аутентичными стандартами. .Оценки MS / MS основаны на сравнении ионов, присутствующих в экспериментальном спектре, с ионами, присутствующими в спектре библиотеки.
Нормализованные площади каждого соединения были масштабированы, чтобы установить медианное значение, равное 1. Значения, полученные для каждой ткани, использовали для метаболомного анализа с помощью MetaboAnalyst 4.0. Анализы данных PLS-DA были нормализованы с использованием шкалы Парето.
1 Н-ЯМР-спектроскопия . MAS 1 H-ЯМР-спектроскопию проводили с использованием образцов (от 13 до 20 мг сырого веса) OB от самцов мышей 12 недель разных генотипов Gadl1 – / – , Gadl1 + / – и Gadl1 + / + .После вскрытия образцы хранили при -80 ° C перед тем, как их поместили в 4-мм роторы ZrO 2 MAS с 50 мкл вставок и проанализировали на приборе Bruker с частотой 500 МГц при 4 ° C. Разделение сигнала воды достигалось импульсами предварительного насыщения. Каждый спектр записывался при скорости MAS 5 кГц с использованием 256 переходных процессов и 5-секундной задержки между каждым переходным процессом. Чтобы облегчить сравнение, максимальные интенсивности сигналов были нормированы на один и тот же уровень для всех образцов.
1 H-МРТ живых животных .Животных анестезировали с использованием 5-6% (об. / Об.) Севофлурана (SevoFlo, Zoetis Inc., Kalamazoo, MI, USA), смешанного с кислородом (200 см 3 / мин) для индукции и ~ 3% для поддержания. В ходе МРТ-экспериментов за частотой дыхания следили с помощью датчика давления (SA Instruments, Нью-Йорк, США). МРТ-исследования были выполнены с помощью сканера User PharmaScan 70/16 (7 T) от Bruker (Bruker BioSpin GmbH, Эттлинген, Германия) с использованием передающей катушки с внутренним диаметром 72 мм вместе с решеткой четырехэлементных катушек на поверхности мозга мыши для получения MR сигнал.Было записано 13 корональных Т2-взвешенных изображений [толщина среза 0,5 мм; расстояние среза 0,05 мм; поле зрения (FOV) 20 мм на 20 мм; размер матрицы 256 на 256] с подавлением жира. Изображения были записаны с использованием турбо-РЕДКОЙ последовательности [время до эха (TE), 38 мс; время повторения (TR), 3200 мс; четыре средних]. Поле зрения охватывало весь мозг, включая OB. Со сканером использовалось программное обеспечение ParaVision 6.0.1. Анализ МР-изображений был выполнен с помощью Fiji ImageJ (версия 1.46a, Национальный институт здравоохранения, Бетесда, Мэриленд, США).OB был вручную очерчен в каждом срезе изображения, и количество пикселей в каждой интересующей области было переведено в измерение объема.
Очистка РНК и qRT-PCR . Тотальную РНК очищали из разных тканей мышей Gadl1 + / + и Gadl1 – / – с использованием набора для очистки RNeasy от QIAGEN (№ 74104; и для мышечной ткани № 74704). кДНК синтезировали в трех повторах из этой РНК с использованием набора для преобразования РНК в кДНК высокой емкости (# 4387406, Applied Biosystems).qRT-PCR выполняли с использованием анализа экспрессии генов TaqMan (TaqMan Gene Expression Master Mix, # 4369016, Applied Biosystems). Зонды TaqMan были следующими: Mm00520087_m1 (CSAD), Mm01348767_m1 (GADL1, экзоны с 13 по 14), Mm01341531_m1 (GADL1, экзоны с 3 по 4), Mm01341534_m1 (GADL1, экзоны с 6 по 9 дегидрогенодегидрофосфат 3–79915-фосфат Mmgdegderal-гидроген-1), Mm (GAPDH)] и Mm00607939_s1 (β-актин). Экспрессия мРНК для всех генотипов была нормализована относительно генов домашнего хозяйства GAPDH и β-актина с использованием варианта (2 Δ C t ) метода Ливака (2 −ΔΔ C t ), как описано в настоящей статье. Краткое руководство по применению ПЦР от Bio-Rad ( 55 ).Значения представлены как средние и верхний предел 95% по шкале ln –.
Секвенирование РНК . Секвенирование РНК выполняли с использованием набора для подготовки цепочечной мРНК TruSeq от Illumina и прибора Illumina HiSeq 4000 (парный конец, 75 п.н., × 2 прогона). Качество исходных данных контролировалось с помощью инструмента FastQC (доступен на www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc). Необработанные считывания были сопоставлены с геномом мыши M13 с использованием HISAT2 ( 56 ). Считывание, выровненное по кодирующим областям генома, было подсчитано с использованием «FeatureCounts» ( 57 ).Нормализацию и дифференциальную экспрессию генов проводили с использованием DESeq2 ( 58 ). В среднем были обнаружены транскрипты от 27 878 генов. Анализ обогащения GO проводился с использованием инструментов TopGo и их зависимостей в среде R (версия 2.36.0). Биологические пути, затронутые делецией Gadl1 , были определены в соответствии с GO ( 27 , 28 ) и KEGG ( 27 , 59 ). Среди 27 878 надежно идентифицированных генов мышей мы дополнительно проанализировали гены с повышенной или пониженной регуляцией с логарифмическим изменением в 2 раза либо меньше -1, либо больше +1 и P ≤ 0.05. Тепловые карты были составлены с помощью ClustVis ( 59 ).
Вестерн-блоттинг . Мы использовали специально изготовленные аффинно очищенные овечьи антитела, созданные против очищенных слитых белков человеческого GADL1 MBP (мальтозо-связывающий белок) (J. Hastie, University of Dundee). Все остальные антитела были приобретены у Abcam. Первичные антитела были анти-SOD1 (1: 2000; CuZn; ab13498), анти-SOD2 (1: 1000; Mn; ab68155) и анти-GLR1 / GSR (1: 5000; ab16801), приготовленные в 3% (мас. v) бычий сывороточный альбумин (BSA) в 1 × трис-буферном физиологическом растворе (20 мМ основания Trizma и 150 мМ NaCl) с 0.1% (об. / Об.) Твин 20 (TBST). Замороженные образцы тканей (OB, SKM и кора головного мозга) гомогенизировали в буфере для анализа радиоиммунопреципитации, содержащем смесь ингибиторов протеаз. Равные количества белка (30 мг) разделяли с помощью SDS-PAGE и переносили на нитроцеллюлозную мембрану (Bio-Rad) с использованием системы переноса Trans-Blot Turbo (Bio-Rad) в соответствии с протоколами производителя. Мембраны блокировали 3% BSA в TBST в течение 2 часов при комнатной температуре перед инкубацией с первичными антителами в течение ночи при 4 ° C.На следующий день мембраны инкубировали с вторичными антителами, иммуноглобулином GH + L против пероксидазы хрена против кролика и козла (1: 10 000; ab6721) (Bio-Rad, Hercules, CA) и проявляли с помощью метода усиленной хемилюминесценции. с помощью набора WesternBright Sirius (# K-12043-D20, Advansta) в системе Gel DocTM XR + (Bio-Rad) с программным обеспечением Image Lab (версия 6.0.1). Все блоты были нормализованы относительно общей белковой нагрузки у мышей Gadl1 + / + .
Поведенческие тесты .В поведенческих экспериментах тестировали 26 мышей-самцов, по 13 мышей от каждого генотипа ( Gadl1 + / + и Gadl1 – / – ). Средний возраст мышей Gadl1 + / + и Gadl1 – / – составлял 22,2 и 21,7 недель соответственно. Порядок тестирования мышей был рандомизирован для каждого теста с задачами в следующем порядке, трехкамерной задачей социального взаимодействия, открытым полем, приподнятым крестообразным лабиринтом и задачей постоянного злоумышленника.Для исключения возможных вариаций, вызванных эстральным циклом самок мышей, использовали исключительно мышей-самцов. При входе всем мышам был присвоен уникальный хвостовой номер. Всех мышей содержали в учреждении для животных в индивидуально вентилируемой клетке (тип 2L, Tecniplast S.p.A., Buguggiate, Италия) с иглу в качестве обогащения окружающей среды и имели неограниченный доступ к воде и пище. Мыши были социально изолированы до задания открытого поля. Мышей содержали при обратном цикле свет / темнота (12:12 часов) в вентилируемом шкафу Scantainer (Scanbur, Karlslunde, Дания) с закатом в 7:30 a.м. при постоянной температуре 24 ° ± 1 ° C. Все экспериментальные процедуры были одобрены Комитетом экспериментов на животных Медицинского центра Университета Радбауд (номер проекта DEC2016-0094), Неймеген, Нидерланды.
Все поведенческие эксперименты проводились в темноте в условиях красного света в одной и той же экспериментальной комнате. Никаких экспериментов не проводилось в течение первого часа после перехода свет / темнота. Всем животным дали 1 месяц на акклиматизацию в помещении для животных перед поведенческим тестированием.Программное обеспечение EthoVision XT9 (Noldus, Wageningen, Нидерланды) использовалось для отслеживания мышей и анализа видео в экспериментах в открытом поле и приподнятом крестообразном лабиринте с программным обеспечением Observer версии 11 (Noldus, Wageningen, Нидерланды), используемым для оценки социальное взаимодействие и эксперименты с постоянными злоумышленниками. Все поведенческие тесты были записаны с помощью высокоскоростной (25 кадров / с) инфракрасной камеры (GigE, Basler AG, Аренсбург, Германия). MediaRecorder (Noldus, Вагенинген, Нидерланды) использовался для записи этих фильмов.
Открытое поле . Двигательную активность определяли в камере для активности размером 55 см на 55 см на 36 см, которая была расположена на плоском столе с камерой непосредственно над центром устройства. Животных помещали в центр поля, где затем в течение 5 мин регистрировали двигательную активность. Арена была разделена на четыре квадранта, в которых соединенные центральные точки всех квадрантов образовывали центр поля и имели размеры 27,5 см на 27,5 см. Измерялось общее время в центральной зоне, вне центра и время, проведенное у стен, а также частота посещений центра.Кроме того, время ожидания выхода из центра использовалось как показатель неподвижности. Пониженная частота посещений центра, скорость и пройденное расстояние использовались как показатели двигательной активности и тревожного поведения. Общее пройденное расстояние измеряли путем отслеживания движения от центра тела мыши. Между тестами арену промывали 70% спиртом. Видеозаписи двигательной активности исследовали с помощью EthoVision XT9 (Noldus, Wageningen, Нидерланды).
Надземный крестообразный лабиринт .Аппарат, предоставленный Нолдусом, состоял из двух открытых рукавов и двух закрытых рукавов (36 см на 6 см, высота стенок 15 см) с общей центральной платформой (6 см 2 ). Аппарат располагался на высоте 60 см над землей. Вначале животных помещали на стыке открытого и закрытого рукавов головой к закрытым рукавам. Подъемный крестообразный лабиринт был выполнен в темноте в условиях тусклого освещения. Время, проведенное в открытом и закрытом рукавах, оценивали как отношение времени (RT). RT – это время, проведенное в открытых рукавах (TO), деленное на общее время, проведенное как в закрытых (TC), так и в открытых рукавах (TO): RT = TO / (TO + TC).Кроме того, измерялась частота переходов между плечами, общее пройденное расстояние и скорость. Между каждым животным лабиринт очищали 70% этанолом и сушили перед тестированием следующего животного.
Парадигма резидента-нарушителя . Для оценки территориальной агрессии использовалась парадигма резидентного злоумышленника. В каждый день тестирования встречалась незнакомая мышь-нарушитель C57BL / 6J, которую случайным образом назначали резиденту для каждого взаимодействия. Всех животных, как резидентов, так и злоумышленников, тестировали один раз в день.В качестве зоны взаимодействия использовалась жилищная клетка жителя. Прозрачный экран из оргстекла был помещен в середину клетки, чтобы предотвратить прямое взаимодействие между животными, но для обеспечения визуального, слухового и обонятельного восприятия. Мышь-злоумышленник помещалась с другой стороны пластикового экрана на 5 мин. После этого экран снимали и взаимодействие снимали на видео в течение 5 мин. После теста злоумышленник был удален из клетки, и оба животных были взвешены и проверены на наличие ран.Частота атак и укусов, а также время ожидания до первой атаки анализировались вручную для всех дней взаимодействия. Задержка атаки составляла 300 с, если атака не произошла в течение 5-минутного окна взаимодействия.
Трехкамерный тест социального взаимодействия . Стандартный трехкамерный манеж (Нольдус, Вагенинген, Нидерланды) использовался в темном помещении с красным верхним освещением. В течение первых 10 минут теста тестовую мышь помещали в одиночку на арену, чтобы она привыкла к новой среде.И в левую, и в правую камеры помещали пустой акриловый цилиндр со стержнями. Через 10 мин интерактивную мышь (мышь C57BL / 6J, того же возраста, что и тестируемая мышь) помещали в цилиндр случайным образом в левый или правый цилиндр. Тестирование было распределено на 2 дня с каждой мышью C57BL / 6J, использованной максимум четыре раза в качестве интерактивной мыши. Порядок тестирования был уравновешен. В течение 10 мин подопытным мышам позволяли исследовать арену с взаимодействующей мышью в ней.
Карнозин-родственные гены в фенотипах человека .Для проведения генного анализа мы получили общедоступные сводные статистические данные от GWAS, проведенные у лиц европейского происхождения (таблица S3). Затем мы ограничили данные, где это возможно, SNP с частотой минорного аллеля 1%, с хорошим качеством вменения (оценка информации вменения,> 0,8), и которые были представлены более чем в 70% от общего размера метаанализированной выборки. . Затем мы рассчитали ассоциацию восьми интересующих генов с выбранными фенотипами с помощью MAGMA ( 39 ).Связи ген-фенотип рассчитывали с использованием индивидуальных значений SNP P для ассоциации с соответствующими фенотипами. SNP были присвоены гену, если их хромосомное положение находилось в пределах начала и конца транскриптов гена (то есть стандартные настройки MAGMA). Мы использовали популяцию с 1000 геномами CEU (северных европейцев из Юты) в качестве контрольной панели для коррекции неравновесия по сцеплению.
Вариант прогнозирования эффекта . Всего Ensembl сообщил о 23 292 SNP в человеческом GADL1, 78% из которых являются интронными.Среди вариантов кодирования 67% были представлены как бессмысленные, 23% как синонимы, 5% как сдвиг кадра, 3% как остановка и 1% как удаление в кадре.
Структурный анализ . Для сравнительного анализа структуры белка использовали структуры GADL1 мыши ( 25 ) (запись PDB 6enz), человеческого CSAD (запись 2jis PDB) и GAD65 человека ( 60 ) (запись PDB 2okk). Чтобы предсказать способ связывания Glu с GAD65, его структура была повторно уточнена, и было обнаружено, что она содержит ингибитор хелидоновую кислоту, на основе которой можно легко получить режим связывания Glu из-за присутствия двух карбоксильных групп, расположенных соответствующим образом.Структуры были наложены в COOT ( 61 ) и визуализированы в Chimera ( 62 ).
Окрашивание гематоксилином и эозином . Для гистохимических исследований органы фиксировали формалином. Образцы заливали парафином и разрезали на срезы толщиной 40 мм. Для окрашивания гематоксилином и эозином срезы депарафинизировали в Tissue-Clear II (2 × 10 мин) и регидратировали, используя 100% этанол (2 × 1 мин каждый), затем 96% этанол (1 мин) и затем 70% этанол в течение 1 минуты. мин и дважды дистиллированной H 2 O (ddH 2 O) в течение 3 мин.Затем срезы погружали в 0,2% -ный гематоксилин (гистолаб) на 5 минут, эозин на 1 минуту с последующей 5-секундной промывкой ddH 2 О. Затем срезы регидратировали в 70% этаноле в течение 30 секунд с последующим погружением. в 96% (2 мин) и 100% этаноле (2 × 2 мин). Наконец, срезы погружали в ксилол на 2 мин, помещали на предметные стекла и закрывали покровным стеклом. Сканер слайдов Hamamatsu использовался для сканирования слайдов, а программное обеспечение Aperio использовалось для фотографирования.
Статистика
Все данные, если не указано иное, представлены как средние значения ± стандартное отклонение.Кривые роста (рис. 1, B и C), анализ активности фермента (рис. 1H), ЯМР (рис. 3C), МРТ и поведение животных (рис. 5, A – E) были проанализированы с помощью непарного теста Стьюдента t. тест (двусторонний). Статистическая значимость была определена как P ≤ 0,05. Данные метаболизма (рис. 2 и рис. S4) были проанализированы с помощью непарного теста Стьюдента t (двусторонний) с поправкой Велча. Уровни антиоксидантов (рис. 4) анализировали с помощью соотношения, парного теста t (двусторонний) для каждой экспериментальной установки.
Одобрение исследования
Протокол, использованный в этой рукописи, был одобрен Комитетом по исследованиям на животных, Норвежское управление по безопасности пищевых продуктов (Mattilsynet, номер разрешения 9468).
Благодарности: Мы благодарим T. Zayats и A. Srivastava за помощь в анализе генетических данных, а также L. E. Schiro, H.O. Rolfsnes, H. Dale и B. Nordanger за экспертную техническую помощь. Финансирование: Эта работа получила финансирование от Stiftelsen Kristian Gerhard Jebsen (SKJ-MED-02), Регионального управления здравоохранения Западной Норвегии (No.25048) и совместное предприятие «Инициатива в области инновационных лекарственных средств 2» в рамках грантового соглашения № 115916 (PRISM). Это совместное предприятие получает поддержку со стороны исследовательской и инновационной программы Европейского союза Horizon 2020 и EFPIA. Центр Genomics Core Facility (GCF) в Университете Бергена, который является частью консорциума NorSeq, предоставляет услуги по секвенированию РНК. GCF частично поддерживается крупными грантами Исследовательского совета Норвегии (грант № 245979 / F50) и Trond Mohn Stiftelse (грант №.BFS2016-геном). Вклад автора: E.M. охарактеризовал все аспекты мутировавших мышей, выполнил анализ мышей, генотипирование, ферментный и вестерн-блоттинг, проанализировал данные MR и ЯМР и написал рукопись. S.C.H. проводил анализы вестерн-блоттингом, анализировал лизаты тканей мыши и данные РНК и помогал в подготовке рукописи. R.K. помог в анализе метаболомных данных. I.W. провела генотипирование и qRT-PCR. Т.-А.Х. проводил генетический анализ человека и помогал в анализе метаболомных данных.Р.М.-П. провели статистический анализ метаболомных данных. C.T. провели спектроскопические эксперименты ЯМР. F.M. провели поведенческие исследования мышей. А.Б. провели исследования qRT-PCR. J.C.G. руководил исследованиями поведения мышей. H.M. выполнено гистологическое исследование тканей мыши. П.К. проанализировали и сравнили белковые структуры. J.H. задумал и руководил исследованием и написал рукопись. Конкурирующие интересы: Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов. Доступность данных и материалов: Все данные, необходимые для оценки выводов в статье, представлены в документе и / или дополнительных материалах. Дополнительные данные, относящиеся к этой статье, могут быть запрошены у авторов.
- Copyright © 2020 Авторы, некоторые права защищены; эксклюзивный лицензиат Американской ассоциации содействия развитию науки. Нет претензий к оригинальным работам правительства США. Распространяется по лицензии Creative Commons Attribution License 4.0 (CC BY).
Кто убил Кирова? ‘
ГЛАВА ОДИН Кто убил Кирова? »
Величайшая тайна Кремля
Автор: Эми Найт,
Хилл и Ван
Прочитать обзор
Декабрьская трагедия
В первые дни осиротевшего Ленинграда Сталин бросился там.Он отправился туда, где было преступление против нашей страны. преданный идее. Лично по Кирову противник не стрелял. Нет! Он стрелял в пролетарская революция.
—Правда, , 5 декабря 1934 г.,
4 декабря 1934 года, когда над Октябрьским вокзалом Москвы начинался холодный, сырой рассвет, большая делегация рабочих, вызванная по этому случаю партией, в трепетном молчании наблюдала, как подъехала Красная Стрела из Ленинграда и гроб. был спущен на платформу.Внутри находилось израненное от пули тело Сергея Кирова, бывшего партийного руководителя Ленинграда, члена Политбюро и известного оратора сталинского режима. Когда рабочие взвалили гроб на плечи, группа кировских бывшие коллеги во главе со Сталиным вышли из поезда, несомненно, утомленные ночной поездкой из Ленинграда. Их лица, почти скрытые в толстых складках воротников пальто и тяжелом мехе шляп, были невыразительны.
Киров был убит ближе к вечеру 1 декабря в Ленинградском партийном штабе в Смольном институте, внушительном неоклассическом здании, которое когда-то было аристократическим девичьим домом. школа.В тот же день, сразу после того, как стало известно о трагедии, Сталин приказал нескольким руководящим партийным деятелям сопровождать его в Ленинград. После поверхностного утешения обезумевшего Кирова вдова Мария Львовна, Сталин и его подчиненные начали расследование преступления. Для высшего политического руководства было крайне необычным покидать столицу для наблюдения за делом, когда НКВД, могущественные и эффективная тайная полиция, по-видимому, была хорошо оснащена, чтобы справиться самостоятельно.Но это не было обычным преступлением. Жертвой стал один из ближайших соратников Сталина. После смерти (очевидным самоубийством) жены Сталина, Надежда Аллилуева, двумя годами ранее, Киров стал незаменимым спутником Сталина, отдыхая с ним на юге и даже имея редкую привилегию (учитывая крайнюю застенчивость Сталина по поводу своего внешний вид) сопровождать его в сауну. Хотя их разделяли сотни километров, они часто разговаривали по телефону – иногда, учитывая неустойчивый стиль работы Сталина, посреди ночи.
Ленинград к тому же был необычным городом. Всего несколькими годами ранее здесь было немало партийных оппозиционеров, которые встали на сторону «левого» Григория Зиновьева в его ссоре со Сталиным. В виде Член Политбюро, руководящего органа Коммунистической партии и глава правительства Ленинграда, Зиновьев вместе с видным большевиком Львом Каменевым выступил против экономического и политического руководства Сталина.После изгнания Зиновьева из Ленинграда в 1926 году Киров, как новый руководитель партии, вел тяжелую борьбу за избавление ленинградской партии от лояльных зиновьевцев. Сталин никогда не доверял ленинградцам, чей город построил Петром Великим в начале восемнадцатого века, чтобы служить “окном на Запад” России, он терпеть не мог. Ленинград, родина самых выдающихся интеллектуальных и культурных деятелей России, казался более Европейский, чем русский.Таким образом, он лично позаботится о том, чтобы в отношении товарища Кирова восторжествовала справедливость.
Расследование дало удивительно быстрые результаты. 3 декабря, всего через день после прибытия Сталина и его группы, газета « Правда » процитировала коммюнике НКВД: «Предварительное следствие Установлено, что злодея, убийцу товарища Кирова, зовут Леонид Васильевич Николаев, 1904 г.р., бывший сотрудник Ленинградской РКИ.Расследование продолжается ». Дальнейшие подробности появились на следующий день. Со ссылкой на НКВД в газетах утверждалось, что Киров готовил в тот вечер доклад для выступления на партийном собрании в Таврическом дворце. Николаев стоял возле офиса Кирова по адресу: Смольный, где он обычно принимал посетителей, и когда Киров «прошел в его кабинет», Николаев подошел сзади и выстрелил ему в шею. Убийцу поймали на месте. Киров был доставлен без сознания в его кабинет, где врачи обнаружили его без пульса и дыхания.Попытки реанимировать его оказались безрезультатными. Пуля, застрявшая в шее жертвы, была той же пулей, что использовалась в револьвере Нагана, который раньше был установлен как оружие. Обстоятельства нападения и путь пули указывали на то, что в жертву стреляли с близкого расстояния.
Как позже выяснится из документов по делу, в отчете были обнаружены любопытные аномалии. Во-первых, предполагаемый убийца Николаев был опознан только как «бывший сотрудник РКИ».” Но он в 1932-33 работал в РКИ (государственном наблюдательном органе); его последним местом работы, с которого он был уволен в апреле 1934 г., был Институт истории партии. Почему следует упомянуть только RKI? Второй, в документах говорилось, что Киров в тот день работал в Смольном, тогда как на самом деле он писал свой отчет дома и неожиданно появился в Смольном ближе к вечеру. Его не расстреливали за пределами его офис, но в добрых пятидесяти пяти футах от офиса второго секретаря Михаила Чудова.Его тело было перенесено в кабинет Чудова, а не Кирова. В дополнение к пуле, которая попала Киров так точно с близкого расстояния был обстрелян еще одним, застряв в карнизе под потолком. И, наконец, не упоминалось о том, что Николаев был доставлен в бессознательном состоянии в специальную медсанчасть НКВД. обращение перед допросом.
Такие неточности могут быть понятны в стране, где есть независимые газеты, которые отправляли репортеров на место преступления и спешили опубликовать новости.Но советская пресса не допускала ошибок. К 1934 году Советский Союз стал при Сталине государством, в котором все формы публичного самовыражения контролировались партией и тайной полицией. Даже мельчайшие детали перед печатью подвергались тщательной проверке. что делает маловероятным, что эти ошибки вкрались случайно. Была ли общественность преднамеренно дезинформирована?
Еще одна важная информация, никогда не появлявшаяся в прессе, заключалась в том, что ключевой свидетель, телохранитель Кирова М.Д. Борисов погиб. в предполагаемом несчастном случае на следующий день после преступления, когда способ быть допрошенным Сталиным. Хотя весть об аварии быстро разлетелась по Ленинграду, газеты полностью проигнорировали это печальное событие, посвятив свои страницы прославлению Кирова.
Убитый вождь стал святым в одночасье. Новости о планах похорон и предательстве Кирова чередовались с острыми заявлениями о потерях от пострадавших рабочих и членов партии.В соответствии одному наблюдателю, молодому советскому дипломату по имени Александр Бармине: «Газеты во время смерти Кирова были заполнены его похвалами и выражениями горя, которые на самом деле намного превышали те, которые последовали за ним. смерть Ленина. По крайней мере, двенадцать дней все советские газеты от первой до последней строчки были посвящены жизни и смерти любимого вождя Кирова ». С поразительной быстротой справилась газета« Правда ». к 5 декабря найти и распечатать обширные биографические данные о Кирове, включая секретное досье из архивов царской полиции.К этой дате и целые книги о Кирове, с воспоминаниями бывших товарищей, рассказы о его детстве и репродукции его выступлений ушли в печать. Это было почти так, как если бы кто-то заранее собрал весь материал и ждал разрешения на сборку.
Убийство Кирова прозвучало и за рубежом, попав на первую полосу журнала . New York Times 2 декабря. Times Московский корреспондент Гарольд Денни сообщил, что смерть Кирова была объявлена накануне ночью, в 23:00. выпуск новостей: “Диктор прервал программу, чтобы сказать что он должен объявить о подлом поступке. Затем он зачитал коммюнике ЦК партии и Совета Народных Комиссаров правительства. Оркестр сыграл на похоронах марш от «Тангейзер», и все трансляции прекратились.«На следующий день, – сообщил Денни», – ошеломленная Москва, задрапированная красными флагами с черной каймой, молча, но с тревогой ждала каких-либо обрывков новостей о вчерашнее убийство “.
Похороны назначены на 6 декабря. Накануне люди весь день стекались в Колонный зал Дома Союзов в Москве, чтобы посмотреть на открытый гроб Кирова. В 22:00. доступ был ограничен семья и высокие партийные и государственные деятели.Справа от гроба сидела вдова Кирова Мария Львовна, рядом с ней сидели две сестры. Она была в плохой форме. Ее здоровье несколько ухудшалось. время, и потрясение от смерти мужа сделало ее бессвязной и едва могла ходить. С ними сидели вдова Ленина Крупская, его сестра Мария и две сестры Кирова, которые объездили сотни лет. миль, чтобы присутствовать на похоронах. Хотя они были близки к Кирову, его сестры не видели его тридцать лет.Они только переписывались. Теперь они видели его в последний раз – мертвым, его лицо «зеленовато-желтый» с черно-синими синяками от раны и падением лицом вниз на пол.
Невестка Сталина Мария Сванидзе, сидевшая с женщинами, описала эту сцену в своем дневнике:
В воздухе стоял тяжелый запах похорон, смешанный с запахом цветов, земли и вечнозеленых растений.Несмотря на полный свет, сквозь слезы казалось, что темно, мрачно и мучительно неуютно … В 11 часов все напряглись, глядя каждую минуту к углу, из которого появлялись великие, наши вожди … Наконец их шаги, твердые и решительные … Иосиф [Сталин] встал во главе Кирова. Играл поминальный марш Шопена …. Иосиф залез на площадку гроба, наклонился и поцеловал в лоб мертвого Сергея Мироновича.Картина разорвала мне душу, я знал, насколько они близки, и весь зал рыдал. Я слышал через свои собственные рыдает, мужчины рыдают.
Мария Львовна к этому времени начала терять сознание. Врачи окружили ее, дали несколько капель. Во время суматохи лидеры молча выскользнули из зала, а гроб был закрыт, готовый к отправке в крематорий.
Следующий день, 6 декабря, был днем из слов «Правды», «который войдет в историю как день великого траура по партии, всей стране, всем рабочим, день похорон. лучшего сына социалистической Родины – Сергея Мироновича Кирова.«В то утро Мария Львовна, поддержанная на руках сестер Кирова, вошла в Колонный зал Дома Союзов, где Сталин и другие политические деятели и военные ждали. В полдень зал был закрыт для публики, а через час началось похоронное шествие. Сталин и другие отнесли урну с прахом Кирова на Красную площадь, где стояло более миллиона рабочих, неся промозглый декабрьский холод в безмолвной тишине.
После двух часов восхваления ближайший соратник Кирова, знаменитый грузинский большевик Григорий (Серго) Орджоникидзе, поместил останки Кирова у Кремлевской стены.Флаги были опущены, головы обнажены, как погребальные звуки трубы нарушили тишину. Всего через два с небольшим года прах Серго будет помещен в стену. Он тоже будет убит пулей, но в его случае предполагается, что он сам, не убийца, произвел выстрел. Серго был испытанным революционером, большевиком, который установил советскую власть в своем родном Закавказье со всей расчетливой жестокостью, необходимой от лучших защитников Советского Союза. государственный.Тем не менее, он был вспыльчивым, чувствительным и эмоциональным, и ему, должно быть, было трудно сдерживать свои чувства во время длительной церемонии. Когда он услышал об убийстве, он сказал своей жене: «Я думал, что Кирич меня похоронит, но оказалось наоборот». Он был настолько потрясен, что полностью потерял голос, что может объяснить, почему он неожиданно не смог выступить на похоронах.
Серго и Киров работали вместе как верные товарищи на протяжении всей кровавой гражданской войны, последовавшей за захватом власти большевиками в 1917 году, и в начале 1920-х годов, когда большевики консолидировались. их правление.После того, как по долгу службы они разошлись по разным местам, они почти ежедневно переписывались, вместе отдыхали и виделись как можно чаще. Их связь была связью глубокого доверия и привязанности, выходящей за рамки это традиционное партийное товарищество. Учитывая атмосферу интриг, разоблачений и фракционной розни, которая характеризовала партийную жизнь к концу 1920-х годов, эта дружба была особенно важна. Теперь Серго Придется столкнуться с трудностями работы в условиях все более диктаторского и деспотического правления Сталина без Кирова.
* ПОТЕРЯ БОЛЬШЕВИКА
Убийство Кирова опустошило не только его семью и друзей. Это вызвало потрясение по всему Советскому Союзу. 48-летний Киров был популярным лидером в партийных кругах – красивым, харизматичный и очень эффективный оратор.Со своим молодым лицом и отсутствием претензий Киров обладал открытой и доступной манерой поведения, которая заставляла людей чувствовать, что они могут ему доверять. В отличие от Сталина, Киров, который редко покидал пределы Кремля и не любил спонтанность, был человеком из тех, кто выскакивал из своей машины с шофером, чтобы пожать руку на улице. В то время как Сталин говорил по-русски С сильным грузинским акцентом слова Кирова звучали ясным и сильным голосом коренного русского, настоящего мужика, человека земли.
Как и Сталин, Киров пережил детство бедности и лишений. Сергей Миронович Костриков родился в 1886 году в маленьком русском городке Уржум (Вятская губерния), в семье мелкого чиновника, чьи запои помешали ему сохранить работу. Отец Кирова избивал членов семьи, как и отец Сталина-алкоголика, и бросил семью, когда Кирову было пять лет.Два года позже, когда его мать умерла от туберкулеза, Киров остался без родителей. Затем его разлучили с двумя сестрами, и остаток детства он провел в местном приюте.
Можно было мало ожидать от жизни с таким неблагоприятным началом, но острый интеллект и сильные амбиции Кирова отметили его как выжившего. Отличившись в местной школе, Киров смог получить средства на учебу на диплом инженера-механика в городе Казани в 1901 году.В 1904 году он переехал в сибирский город Томск, намереваясь продолжить свое образование, но вскоре увлекся революционным трудом. пыл. К 1905 году, году первой революции, он стал большевиком.
Его последующая карьера профессионального революционера, борющегося с режимом царя Николая II, положила конец его формальному образованию. Но его жажда знаний оставалась сильной, и он с жадностью читал: особенно, когда он сидел в царских тюрьмах за нелегальную революционную деятельность.Киров не ограничивал тюремное чтение марксистской литературой, но читал произведения Достоевского, Чехова, Толстого, Герцена, Виктора. Гюго и Анатоля Франса, и даже занимались Гегелем, Декартом и Спинозой. Он также читал Библию, где нашел «много интересного». Его страсть к книгам никогда не уменьшалась. Когда Киров умер, он оставил личное библиотека более 20 000 томов.
Киров любил писать, о чем свидетельствуют его длинные письма из тюрьмы к жене Марии Львовне, и он хорошо высказывался по самым разным предметам, от философии до литературной критики.В 1909 г., когда революционная движение было приостановлено, он устроился журналистом в либеральную газету во Владикавказе, городе на Северном Кавказе. В течение следующих восьми лет, с перерывами на аресты и ссылку, он регулярно сотрудник, а с 1915 года старший редактор газеты.
По общему мнению, Киров не соответствовал большевистскому стереотипу целеустремленной беспощадности.Его терпимое отношение к различным политическим взглядам отличало его от тех, кто поднялся до руководящих должностей. в 1920-е гг. Он не уклонялся от дружбы с представителями других политических партий, таких как социалисты-революционеры, и вплоть до революции 1917 года он так тесно сотрудничал с главными конкурентами большевиков, меньшевики, что впоследствии его политические соперники обвинили его в том, что он сам меньшевик.
Гуманность Кирова особенно выделяется по сравнению со Сталиным, чье отсутствие угрызений совести и очевидное безразличие к чужим страданиям было очевидно уже в дореволюционный период. В В письме Марии Львовне из тюрьмы 1911 года Киров описал казнь и свою реакцию на нее: «Какое у меня ужасное настроение! У меня есть все основания предполагать, что сегодня вечером я стану свидетелем кошмара, просто ужасное событие.Кажется, я вот-вот услышу звук топора палача … Когда ты свободен, ты не испытываешь такого ужаса так непосредственно. Вот когда такое «обычное событие» происходит почти на ваших глазах – это неописуемо сложно. Но как безгранична душа человеческая! Люди привыкают к таким казням и проводят их с поразительным безразличием ».
Сталин, напротив, мало реагировал на казни, которые происходили, когда он находился в тюрьме до революции.По словам одного биографа Исаака Дойчера: «В напряжении таких моменты, Коба [Сталин], если верить очевидцу, крепко засыпал, поражая своих товарищей своими сильными нервами, или же он продолжал свою неудачную попытку овладеть тонкостями немецкого языка. грамматика “.
Каким бы нетипичным ни был Киров, он присоединился к большевикам, и к концу гражданской войны в 1921 году у них все были в крови.Их безжалостное подавление противников большевиков. захват власти в 1917 году унес более миллиона жизней, включая жизни ни в чем не повинных мирных жителей. Справедливость была принесена в жертву революционному делу, и Киров стал знаменосцем этого дела. Он впервые привлек внимание Ленина и Сталина, когда он служил главой большевистского революционного комитета в Астрахани, ключевом оплоте у подножия Кавказа, и успешно подавил там антибольшевистское восстание в 1919 г.Позже он был членом Реввоенсовета 11-й армии, которая вторглась в Азербайджан в 1920 году, а затем вторглась в Армению и Грузию. В качестве главы Коммунистической партии Азербайджана с 1921 по В 1926 году Киров установил советскую власть над невольными азербайджанскими националистами, страна которых до вторжения 1920 года имела непродолжительный период независимости. Письма и телеграммы Кирова его начальникам в Москву составляют Было ясно, что он делал все, что было в его силах, чтобы привести республику в соответствие.
В 1926 году, когда Сталин хотел раз и навсегда избавить ленинградский аппарат от сторонников Зиновьева, он выбрал на эту должность Кирова. Надо сказать, что Кирову не понравилось новое назначение Ленинградом. партийный руководитель. В самом деле, он горько жаловался в письмах жене и друзьям на то, насколько трудной и неприятной была эта работа. Но он не мог отказать Сталину. Хотя он сохранил санкции против бывших зиновьевцев, чтобы как минимум, пытаясь вернуть их в лоно большевиков, он публично выступал против них и председательствовал на бесконечных митингах, на которых их осуждали.
В процессе реорганизации ленинградской организации Киров заработал несколько врагов. В 1929 году группа старых ленинградцев даже обратилась с жалобами на него к партийному руководству в Москву, раскапывая некоторые из его дореволюционных газетных статей, чтобы показать, что он имеет буржуазные наклонности. В конце концов, Киров пережил нападение, но не без черной отметки на своем послужном списке.
Начало 1930-х годов было занято реализацией первой сталинской пятилетки, начатой в 1928 году.План предусматривал головокружительную индустриализацию, сопровождаемую коллективизацией сельского хозяйства. Миллионы крестьян по всему Советскому Союзу были выселены из индивидуальных владений и отправлены в колхозы. Крестьянское сопротивление привело к кровавым столкновениям с властями, а также к голоду. Хорошо при этом погибло более миллиона крестьян. Киров не был в восторге от политики насильственной коллективизации – и на самом деле процесс в Ленинградской области проводился гораздо медленнее, чем в другие части страны.Тем не менее он согласился с директивами Москвы. Открытое сопротивление не было в стиле Кирова, и бросить вызов Сталину в этом вопросе, как это сделал его товарищ-большевик Николай Бухарин, означало бы означали конец его политической карьеры.
Мы не знаем, какие этические уравнения делал Киров в этот момент, как он оправдывал перед собой гибель людей и репрессии, за которые он был ответственен.Он по-прежнему заслужил свою репутацию как «умеренный» большевик; он не был мстительным догматиком и не проявлял склонности к беспричинной жестокости. Но, присоединившись к Сталину и заявив о поддержке его руководства, он начал жизнь морального компромисса.
Действительно, в контексте сталинской России популярность была весьма относительным понятием. Киров был «популярен» лишь постольку, поскольку мог быть одним из лидеров жестокого репрессивного правительства.Недавно рассекреченный Секретные информационные отчеты местных партийных чиновников показывают, что ленинградский пролетариат был глубоко недоволен экономической ситуацией, особенно предложенным прекращением карточного хлеба. Некоторые рабочие и крестьяне из Ленинградской области обвинили Кирова в их тяжелом положении и, таким образом, отреагировали на известие о его смерти, выразив безразличие или презрение.
Но большинство партийцев очень уважали Кирова.Режим был еще молод, и многие коммунисты верили в непрекращающуюся пропаганду – что теперь они страдают, чтобы построить блестящий социалистический строй. будущее. Киров был частью руководства, которое пресса изображала мудрым, всемогущим и преданным делу общества. Более того, он излучал такую энергию и авторитет, которые заставляли людей уважать ему.
(Продолжение…)
(C) 1999 Эми Найт Все права защищены. ISBN: 0-8090-6404-9
.