МБОУ Ставровская СОШ Собинского района
28-04-2018
С целью приобщения молодежи к профессиям сельскохозяйственной направленности и в преддверии праздника Дня Победы 26 апреля 2018 года состоялась экскур…
19-04-2018
19 апреля команда «Потешного полка» по результатам областного конкурса молодёжных военно-патриотических клубов и объединений стала лауреат…
16-04-2018
16 апреля 1982 года родился Якимкин Павел Борисович Герой Российской Федерации. В музейном центре Горохова Г.Н. в память о Герое, выпускнике&nb…
16-04-2018
16 апреля в годовщину Дня рождения Якимкина Павла Борисовича обучающиеся 8-х классов посетили памятник Герою России, выпускнику школ…
11-04-2018
Дата, место, время родительского собрания:
19 апреля 2018 года в 17.
11-04-2018
11 апреля в ОО прошёл общешкольный День здоровья. В этот день со всеми 1-11 классами была проведена мотивационная акция «Будь здоров» с аг…
03-04-2018
02 апреля 2018года в 11 часов 30минут была проведена учебная тренировка по эвакуации обучающихся, работников, с участием представителей родительской о…
26-03-2018
26 марта на территории МБОУ Ставровской СОШ начала работу Школа юного законотворца Собинского района. В первый день обучающиеся 9-11 класс…
25-03-2018
23 марта на базе МБОУ Ставровская СОШ проходил конкурс «Робот-2018» среди учащихся, посещающих кружок «Робототехника» из школ Толпухово,&…
23-03-2018
22 марта в Доме детского творчества г.
Собинка прошел заключительный окружной семинар областной Школы добровольца. С добровольцами Собинского р…
23-03-2018
21 марта 45 обучающихся школы совершили экскурсионную поездку в г. Ярославль в Музей боевой славы и обзорную экскурсию по городу. Все дети и педагоги …
22-02-2018
22 февраля наша школа организовала и провела в п. Ставрово Вахту памяти. Детское военно-патриотическое объединение «Потешный полк» возложили гирлянду …
22-02-2018
22 февраля состоялась торжественная линейка, приуроченная вахте памяти. В большом спортивном зале состоялась торжественная линейка, где присутствова…
22-02-2018
21 февраля в нашей школе была проведена традиционная и любимая мальчишками военно-спортивная игра «Зарница». В ней участвовали мальчишки и юноши 5-11 .
..
15-02-2018
15 февраля в ОО состоялись масленичные гуляния. Масленица проходила для начальной школы у входа на улицу. Обучающиеся вспомнили давнюю традицию Руси -…
15-02-2018
Прием заявлений на ГИА до 1 МАРТА 2018 ГОДА осуществляется в МБОУ Ставровской СОШ заместителем директора по УВР Ливаевой О.Ю.
13-02-2018
13 февраля состоялся общешкольный форум наук. В рекреациях заранее были оформлены плакаты, проводились опыты, разыгрывались интерактивные игры, которы…
11-01-2018
Фонд поддержки детей создал серию рекламных материалов по пропаганде ценностей семьи, ребенка, ответственного родительства. Теме мног…
14-12-2017
7 декабря в школе состоялась интеллектуальная игра «Герои Советского Союза Собинского района» среди 7-х классов.
Команды трёх классов отвечали на след…
14-12-2017
С 1 по 8 декабря в ОО был реализован общешкольный проект «Герои Отечества». На старте проекта 1 декабря прошли районные военно-патриотические соревнов…
14-12-2017
7 декабря в рамках месячника безопасности на воде состоялась встреча 7,9, 10 и 11 классов с сотрудниками МЧС: Алиевым Гасаном Гасанбейковичем, государ…
14-12-2017
С 5 по 8 декабря в рамках общешкольного проекта «Герои Отечества» обучающиеся школы возложили цветы к памятникам и мемориалам Героев Отечества в п. Ст…
07-12-2017
С 11 по 20 декабря в нашей школе состоится неделя строительства, ЖКХ, транспорта. Запланированы следующие мероприятия: № п/п Форма прове…
07-12-2017
6.
12.2017 года в МБОУ Ставровской СОШ, которая является стажерской площадкой по теме
«Реализация ФГОС НОО в «Школе полного дня», прошел облас…
04-12-2017
Уважаемые обучающиеся 5-11 классов и родители! Наша школа является муниципальной площадкой для проведения международной акции «Тест по истории Оте…
03-12-2017
2 декабря состоялась поездка ДВПО «Потешный полк» в д. Монино Нижегородской области в воинскую часть, где служил герой России, выпускник Ставровской ш…
01-12-2017
1 декабря в ФОКе состоялись районные военно-патриотические соревнования памяти героя России Якимкина Павла Борисовича. В соревнованиях приняли участ…
01-12-2017
29 ноября в ОО состоялось общешкольное родительское собрание «Безопасность ребёнка в 21 веке», где рассматривались следующие вопросы: безопасность реб.
..
01-12-2017
28 ноября состоялась линейка для 1-4 классов. Обучающиеся получили грамоты за участие в общешкольных конкурсах рисунков «Путешествие по книжному океан…
01-12-2017
28 ноября состоялся КВН среди трёх школьных команд: команды 10 класса «Себе на уме», команды 11 класса «Тариф Лосось» и команды учителей «Непобеждённы…
23-11-2017
20 ноября состоялись уже 9 районные «Труфиловские чтения» в Доме культуры г. Собинка, которые были посвящены произведениям родных поэтов о Родине. Н…
22-11-2017
22 ноября 2017 года состоялась экскурсия учащихся 10-11 классов в МБДОУ Детский сад №4 п. Ставрово. Во время экскурсии старшиклассницам рассказа…
22-11-2017
21 ноября состоялся старт проекта «Вахта памяти», в День памяти воинов, погибших в локальных конфликтах.
21-11-2017
21 ноября в рамках Недели социальной сферы девятиклассники совершили экскурс в профессию «Так кто же он такой- библиотекарь», который прошёл в МКУК МЦ…
21-11-2017
В рамках Дня правовой помощи 20 ноября в ОО состоялся час правовых знаний «Имею права» для обучающихся 6-х классов с заведующей правовой школой по про…
21-11-2017
20 ноября в рамках Дня правовой помощи состоялась встреча- диспут с кандидатом юридических наук, доцентом, заместителем директора Юридического институ…
21-11-2017
20 ноября в рамках Дня правовой помощи состоялась встреча обучающихся 7-х классов с инспектором по делам несовершеннолетних Спиряновой В.А. Речь шла…
18-11-2017
С 10 ноября по 17 ноября в школе прошёл общешкольный турнир по футболу.
Среди 5-6 классов 1 место занял 5 Б класс, 2 место 6 Б класс, 3 место …
18-11-2017
17 ноября вечером в ОО состоялось современное молодёжное мероприятие в формате квартирника «Поэзия любви». Задумано, организовано и проведено оно сила…
18-11-2017
16 и 17 ноября для учащихся 1-4 классов в рамках проведения общешкольных Дней толерантности состоялась общешкольная игра-путешествие по станциям «Разн…
17-11-2017
15 ноября в 4 классах сотрудник детской библиотеки Знаменская Ирина Юрьевна провела час интересных сообщений «Дружат дети на планете». 16 ноября за…
17-11-201716 ноября 2017 года в департаменте образования администрации области в режиме видеоконференцсвязи состоялось областное родительское собрание. На собра…
17-11-2017
17 ноября 2017 г.
учащиеся 5-6 классов МБОУ Ставровская СОШ выехали на экскурсию в ВПОО Милосердие и порядок г. Владимир.
Экскурсия была п…
16-11-2017
14 ноября учащиеся 10 и 11 классов побывали в Белом доме, в администрации Владимирской области. Депутат Законодательного собрания Владимирской…
16-11-2017
10, 14-15 ноября обучающиеся 9-11 классов посетили музей в МБУК ЦКиС п. Ставрово. Мероприятие называлось вечер-портрет «У края ядерной бездны», посвящ…
С 17 – 24 ноября 2017 года В МБОУ Ставровская СОШ будет проходить неделя соцальной сферы. На этот период запланированы следующие мероприятия: …
09-11-2017
На сайте Минобрнауки опубликован приказ, подписанный 20 октября 2017 года министром образования и науки О.Ю.Васильевой «О проведении мониторинга .
..
06-11-2017
5 ноября учащиеся Ставровской школы совершили экскурсионный тур в г.Ковров. В результате поездки ребята увидели достопримечательности города, старин…
05-11-2017
В.В. Путин: “Наряду с историей Отечества, русским языком, литературой география служит основой формирования патриотических ценностей, культурной, на…
05-11-2017
В День народного единства, который отмечает вся страна 4 ноября, на площади Победы в г. Владимир состоялся I региональный Слёт юнармейского дв…
05-11-2017
4 ноября обучающиеся 5-9 классов МБОУ Ставровской СОШ, которые были награждены грамотами на общешкольной линейке совершили долгожданную поездку в Моск…
03-11-2017
Первого и второго ноября в Ставровскую школу приходили ребята подготовительных групп из детских садов №4 «Колосок» и №5 «Берёзка».
Для ребят была орга…
02-11-2017
31 октября учащиеся Ставровской школы совершили путешествие по культурно-познавательному маршруту «Есенинская Русь» в Рязанскую область. Ребята поб…
02-11-2017
2 ноября с осеннем оздоровительном лагере прошла игра-эстафета «Крестьянский быт». Целью игры было познакомить детей с предметами крестьянского быта…
02-11-2017
В лагере с дневным пребыванием «Солнышко» было выдано 150 путёвок для детей школьного возраста. Школьники были объединены в 5 отрядов. Отряд…
27-10-2017
27 сентября 2017г. в п. Ставрово состоялась юбилейная игра «Мисс Осень», в которой участвовали обучающиеся 7, 8, 9 классов. От 7 А класса выступала Ба…
26-10-2017
23 и 25 октября в школе прошло заключительное мероприятие 1 четверти «Праздник урожая», в котором участие приняли все 12 классов начальной школы и 5-6.
..
25-10-2017
25 октября учащиеся 11 класса Ставровской школы совместно с молодыми педагогами Федоровой Ю.О., Скоробогатовой Е.Н. и Чихачевой Ю.М. ездили на ежего…
25-10-2017
25 октября состоялся интеллектуальный турнир среди обучающихся 5-6 классов МБОУ Ставровской СОШ и МБОУ Бабаевской ООШ. Интересные вопросы и смелые отв…
23-10-2017
С 9 по 22 октября была проведена районная добровольческая акция «Осенняя неделя добра». Приоритетными направлениями акции являлись: -пат…
20-10-2017
В рамках недели промышленности 20 октября для обучающихся 9-х классов состоялась встреча с руководителем торгового сектора Фёдоровым Артёмом Викторови…
20-10-2017
20 октября по многолетней традиции в школе прошёл Праздник урожая для обучающихся 5-х классов.
Ребята в ярких костюмах показали свои весёлые и запомин…
20-10-2017
В рамках недели промышленности, 20 октября, в школе прошла встреча «Моя будущая профессия» для учащихся 9-11 классов с технологом с обязанностями ми…
19-10-2017
19 октября в школе состоялся песочный спектакль «Волшебство песочной анимации». Для ребят начальной школы была рассказана сказочная история под красив…
17-10-2017
В рамках недели промышленности 17 октября для обучающихся 5-х классов состоялся мастер-класс по деревообработке и столярному делу в школьной м…
17-10-2017
16 октября в школе состоялись торжественные линейки «Наши достижения» для обучающихся 1-11 классов. Ученики 1-4 классов были награждены за участие и п…
16-10-2017
Президент России Владимир Путин считает, что Единый государственный экзамен (ЕГЭ) в России во многом себя оправдал, но такой способ проверки з.
..
15-10-2017
В соответствии с Федеральным законом «О воинской обязанности и военной службе», Указом Президента и Приказом Министерства обороны РФ с 1 октября 201…
13-10-2017
Управление образования информирует о том, что 17 октября 2017 года руководитель Федеральной службы по надзору в сфере образования и науки Сергей Кравц…
10-10-2017
С 10 октября 2017 года по 27 октября 2017 года проводится школьный этап Всероссийской олимпиады школьников по общеобразовательным предметам Распис…
05-10-2017
5 октября в ОО прошёл День самоопределения. В нём участвовали все обучающиеся 10-11 классов. Ребята пробовали себя в роли учителя-предметника, учителя…
04-10-2017
4 октября в ОО прошёл День ГО и ЧС.
ДВПО «Потешный полк» провели для обучающихся 1-11 классов интересное путешествие по станциям безопасности. А для 1…
01-10-2017
1 октября Пионерский отряд «Дари добро» МБОУ Ставровской СОШ со своим руководителем Федоровой Юлией Олеговной провели акцию «Поможем братьям нашим мен…
30-09-2017
30 сентября в школе прошло торжественное мероприятие, посвящённое 140 летнему юбилею образования в посёлке Ставрово. На это мероприятие были приглашен…
18-09-2017
В целях повышения информированности родительского сообщества о правилах правильного поведения в Интернет-пространстве 13 сентября 2017 в МБОУ Ставровс…
04-09-2017
Старшеклассники вместе с главой администрации Собинского района Александром Всеволодовичем Разовым и начальником управления образования администрации .
..
02-09-2017
2 сентября в школе прошёл Всероссийский экологический субботник «Зелёная Россия». 10-11классы провели уборку на территории школы и прилегающей (на ра…
02-09-2017
2 сентября 5, 6, 7 классы участвовали в спортивно-историко-краеведческой игре по станциям «Экологическая тропа» : 1 станция-географическая 2станция-…
02-09-2017
1 сентября День знаний – это праздник для всех учеников, учащихся, их родителей, учителей, а также всех тех людей, которые хоть как-то связа…
31-08-2017
31 августа 45 обучающихся из нашей школы совершили обзорную экскурсию по городу Суздаль. Суздаль- маленький городок, наполненный достопримечательностя…
28-08-2017
28 августа 45 обучающихся посетили столицу Российской Федерации.
У стен Московского Кремля раскинулась, пожалуй, одна из самых известных достопримечат…
28-08-2017
С 24 по 28 августа 10 обучающихся-старшеклассников нашей школы, победители областных и всероссийских конкурсов, совершали экскурсионную поездку в горо…
10-04-2017
6 апреля наша команда «Ставроград» участвовала в районном интеллектуальном турнире «О малой родине- с большой любовью» в МБУ ДО ДДТ г. Собинки. Ребята…
10-04-2017
В рамках декады профилактики правонарушений, которая проводится с 27 марта по 5 апреля, прошли встречи с инспектором ОДН. Обучающиеся начальной школы …
07-04-2017
7 апреля в школе прошёл День здоровья. В рамках этого дня был проведён единый классный час. У младших школьников состоялись традиционные и весёлые эст..
.
06-04-2017
5 апреля наша школа встречала гостей из Ковровского района: Александра Николаевича Самохвалова, директора МБОУ «Малыгинской СОШ», Юрия Павловича Щерба…
30-03-2017
30 марта учащиеся нашей школы в рамках Дней защиты от экологической опасности и дней литературы и театра в ОО провели мотивационную акцию «Берегите Зе…
29-03-2017
29 марта в школе в рамках дней литературы и театра прошло мероприятие «Читающая школа»: выставка сэлфи «На фоне книжного шкафа» и демонстрация буктрей…
25-03-2017
Торжественное открытие Форума при участии губернатора Светланы Орловой и заместителя министра обороны РФ Н. Панкова состоялось 24 марта 2017 года на П…
25-03-2017
24 марта в Собинском Доме детского творчества г. Собинки состоялся второй муниципальный фестиваль – конкурс хоровых коллективов образовательных органи…
| Основные сведения
| ||||
| Дата создания | 19.08.2009 год – МОУ Ставровская общеобразовательная средняя школа Собинского района (Постановление главы Собинского района № 855 от 11.06.2009г.О реорганизации МОУ Ставровской средней общеобразовательной школы №1 Собинского района и МОУ Ставровской средней общеобразовательной школа №2 Собинского района в форме слияния) 01 .07.2011 года.- МБОУ Ставровская средняя общеобразовательная школа Собинского района . Постановление главы муниципального образования Собинский район Владимирской области № 555 от 01.07.2011г. «О переименовании образовательных учреждений Собинского района» | |||
| Сведения об учредителе | Управление образования администрации муниципального образования Собинский район | |||
| Адрес учреждения | 601220, Владимирская обл. , Собинский район, п. Ставрово, ул. Школьная, д.6 | |||
| Режим, график работы | ссылка на документ | |||
| Контактный телефон (факс) | 8(49242) 5-26-64/ факс 5-26-64 | |||
| Никишина Лариса Анатольевна | ||||
| Адрес web-сайта учреждения образования | http://stavrovoschool.ucoz.ru | |||
Структура и органы управления образовательной организации
| ||||
| Структура и органы управления образовательной организацией | Структура управления МБОУ Ставровской средней общеобразовательной школы Собинского района Владимирской области | |||
| Документы | ||||
| Устав образовательной организации | Ссылка на Устав, последняя страница Устава Изменения и дополнения в Уставе Устав в новой редакции, действующей с 01. | |||
| Лицензия на право ведения образовательной деятельности | Серия 33Л 01№ 0000693 Лицензия 2 лист Лицензия (приложение) | |||
| Свидетельство о государственной аккредитации | Свидетельство (титульный лист) Свидетельство (приложение) | |||
| План финансово-хозяйственной деятельность | Ссылка на план финансово- хозяйственной деятельности | |||
| Локальные нормативные акты | Правила внутреннего распорядка обучающихся Правила внутреннего трудового распорядка Коллективный договор | |||
| Отчёт о результатах самообследования | ссылка на отчёт на 01.08.2014 ссылка на отчёт на 01. | |||
| Платные образовательные услуги | ссылка на документы | |||
Предписание органов , осуществляющих государственный контроль(надзор) в сфере образования; Отчёты об исполнении предписаний | 1. Проверка пищеблока 10.10.2014 2. Проверка отдела надзора и контроля в сфере образования и регламентации деятельности образовательных учреждений департамента образования с 20.01.2015 по 16.02.2015 Отчёт об исполнении предписания об устранении нарушения Уведомление об исполнении предписания 3. Проверка “Доступная среда”(приказ) Акт о проверке “Доступная среда”
| |||
| Образование | ||||
| Сведение о государственной аккредитации | Серия ОП №009864, регистрационный № 83 от 11 мая 2010. действительно до 11 мая 2015 титульный лист приложение | |||
| Реализуемые образовательные и программы | -Основное общее начальное образование (1-4 класс) – Основное общее образование 5-9 классы – Основное среднее образование 10-11 классы | |||
| Учебный план | ссылка на документ | |||
| Рабочие программы | аннотации к рабочим программам 1-4 классы | |||
| Количество обучающихся | 2014-2015 год- 698 обучающихся | |||
| Языки образования | Обучение ведётся на русском языке. В качестве предмета, иностранный язык учащимся предоставляется выбор английский или немецкий языки | |||
| Образовательные стандарты | ||||
В школе реализуются: Федеральные государственные стандарты начального основного общего образования ФГОС НОО Федеральные государственные стандарты основного общего образования (в пилотном режиме) ФГОС ООО Образовательные государственные стандарты (2004 года)
| ||||
| Руководство, педагогический состав | ||||
| Педагогические кадры | ||||
| Материально-техническое обеспечение и оснащённость образовательного процесса | ||||
| Материально-техническая обеспеченность учебно-образовательного процесса | 1. 2.По национальному проекту получены кабинеты: физики, химии, географии. | |||
| Уровень информационной обеспеченности | 1. Библиотека, медиатека, аудиотека, видиотека. (Перечень медиатеки)2.Интернет. Сайт школы и электронный адрес: http://www. stavrovoschool.ucoz.ru Е-mail: [email protected] 3. Информационно-библиотечный центр школы включён в региональную Библиотечную информационную систему библиотек Владимирской области (БИСС). | |||
| Финансово-хозяйственная деятельность | ссылка на документы | |||
| Вакантные места для приёма(перевода) | вакантных мест нет | |||
07.2014 года
08.2015
Количество компьютеров 106 шт.(все включены в локальную сеть)Статистика Онлайн всего: 1 Гостей: 1 Пользователей: 0 |
| Календарь
Важно!!! Сообщить об опасном контенте“Горячая линия” Департамент образования: 8(4922)33-46-38, 33-11-95, | ||||
vladimir.ru/.
Активно проводилась пропаганда Президентских игр, использовались болельщиками атрибуты и эмблемы этих игр.
Показан был увлекательный фильм о жизни Потешного полка, существующего уже 18 лет. Дошкольники с удовольствием с командой Потешного Полка шагали под марш, а затем выступили с чтением стихотворений и песнями.
На фестиваль были приглашены дети войны. Каждый класс приготовил стихотворения, свою солдатскую песню и её историю создания. Звучали всем знакомые: «Смуглянка», «Журавли», «Катюша», «Синий платочек», «Священная война» и многие другие («На безымянной высоте», «На поле танки грохотали», «На солнечной поляночке», «Десятый наш десантный батальон», «Хотят ли русские войны»). Фестиваль прошел в дружной, творческой обстановке. В конце проведения фестиваля мы почтили память всех воинов, павших в Великой Отечественной войне минутой молчания и исполнили известную песню «День Победы».
В течение первой недели, которая прошла под названием «Равнина городов героев», были проведены мини-проекты по городам- героям и городам воинской славы во всех классах нашей школы. В итоге была оформлена выставка газет. Также учащиеся присоединились к районной акции «Подарок ветерану». В рамках реализации проекта «Дорога к Победе» был составлен график посещения музеев и просмотров фильмов.| Краткое наименование организации | Полное наименование организации | ФИО руководителя | Адрес организации | |
| Общеобразовательные организации | ||||
| 1 |
МБОУ СОШ № 1 г.
|
муниципальное бюджетное общеобразовательное учреждение Собинского района средняя общеобразовательная школа № 1 г. Собинки |
Тишкина Инна Борисовна, 2-19-66 |
601202, Владимирская обл., г. Собинка, ул. Гагарина, д. 22 |
| 2 | МБОУ ООШ № 2 г. Собинки | муниципальное бюджетное общеобразовательное учреждение Собинского района основная общеобразовательная школа №2 г. Собинки | Акимов Константин Сергеевич, 2-23-01 | 601201, Владимирская обл., г. Собинка, ул. Красная Звезда, д. 16 |
| 3 | МБОУ СОШ № 4 г.Собинки | муниципальное бюджетное общеобразовательное учреждение Собинского района средняя общеобразовательная школа № 4 г.Собинки | Бусурина Валентина Вячеславовна, 2-27-80 | 601204, Владимирская обл., г. Собинка, ул. Чайковского, д. 3-а |
| 4 | МБОУ СОШ № 1 г. Лакинска |
муниципальное бюджетное общеобразовательное учреждение средняя общеобразовательная школа № 1 г. Лакинска Собинского района | Семахин Егор Юрьевич, 4-11-02 | 601241, Владимирская обл., Собинский район, г. Лакинск, ул. Лермонтова, д. 48 |
| 5 | МБОУ СОШ № 2 г.Лакинска | муниципальное бюджетное общеобразовательное учреждение средняя общеобразовательная школа № 2 г.Лакинска Собинского района | Врио Григорьева Светлана Юрьевна, 4-15-80 | 601243, Владимирская обл., Собинский район, г. Лакинск, ул. Кирова, д. 2 |
| 6 | МБОУ Ставровская СОШ | муниципальное бюджетное общеобразовательное учреждение Ставровская средняя общеобразовательная школа Собинского района | Никишина Лариса Анатольевна, 5-26-64 | 601220, Владимирская обл., Собинский район, п. Ставрово, ул. Школьная, д. 6 |
| 7 | МБОУ Асерховская СОШ | муниципальное бюджетное общеобразовательное учреждение Асерховская средняя общеобразовательная школа Собинского района | Бусыгина Надежда Анатольевна, 3-91-96 | 601216, Владимирская обл. , Собинский район, п. Асерхово, ул. Школьная, д. 7 |
| 8 | МБОУ Воршинская СОШ | муниципальное бюджетное общеобразовательное учреждение Воршинская средняя общеобразовательная школа Собинского района | Погодина Маргарита Арнольдовна, 3-22-38 | 601211, Владимирская обл., Собинский район, с. Ворша, ул. Молодёжная, д. 17 |
| 9 | МБОУ Зареченская СОШ имени Героя Советского Союза А. И. Отставнова | муниципальное бюджетное общеобразовательное учреждение Зареченская средняя общеобразовательная школа Собинского района имени Героя Советского Союза Алексея Ивановича Отставнова | Алексеева Татьяна Владимировна, 6-91-42 | 601246, Владимирская обл., Собинский район, с. Заречное, ул. Парковая, д. 9 |
| 10 | МБОУ “Рождественская СОШ” | муниципальное бюджетное общеобразовательное учреждение “Рождественская средняя общеобразовательная школа “Собинского района | Аскерова Анфисия Леонидовна, 5-53-46 | 601232, Владимирская обл. , Собинский район, с. Рождествено, ул. Порошина, д. 10 |
| 11 | МБОУ “Толпуховская СОШ” | муниципальное бюджетное общеобразовательное учреждение “Толпуховская средняя общеобразовательная школа” Собинского района | Туманова Вера Владимировна, 5-75-98 | 601225, Владимирская обл., Собинский район, д. Толпухово, ул. Молодёжная, д. 14 |
| 12 | МБОУ Черкутинская ООШ им.В.А.Солоухина | муниципальное бюджетное общеобразовательное учреждение Черкутинская основная общеобразовательная школа им.В.А.Солоухина Собинского района | Бусурина Виктория Сергеевна, 5-57-21 | 601215, Владимирская обл., Собинский район, с. Черкутино, ул. Солоухина, д. 22 |
| 13 | МБОУ Бабаевская ООШ | муниципальное бюджетное общеобразовательное учреждение Бабаевская основная общеобразовательная школа Собинского района | Гончарова Елена Викторовна, 5-52-82 | 601214, Владимирская обл. , Собинский район, с. Бабаево, ул. Полевая, д. 10 |
| 14 | МБОУ Березниковская ООШ Собинского района | муниципальное бюджетное общеобразовательное учреждение Березниковская основная общеобразовательная школа Собинского района | Кормильцева Любовь Александровна, 3-02-34 | 601217, Владимирская обл., Собинский район, с. Березники, ул. Центральная, д. 13 |
| 15 | МБОУ Кишлеевская ООШ | муниципальное бюджетное общеобразовательное учреждение Кишлеевская основная общеобразовательная школа Собинского района | Глухарева Светлана Александровна, 5-63-41 | 601224, Владимирская обл., Собинский район, с. Кишлеево, ул. Строителей, д. 19-а |
| 16 | МБОУ Куриловская ООШ | муниципальное бюджетное общеобразовательное учреждение Куриловская основная общеобразовательная школа Собинского района | Фокина Валентина Александровна, 3-62-95 | 601223, Владимирская обл. , Собинский район, д. Курилово, ул. Молодёжная, д. 9 |
| 17 | МБОУ Устьевская ООШ | муниципальное бюджетное общеобразовательное учреждение Устьевская основная общеобразовательная школа Собинского района | Попова Наталья Юрьевна, 3-76-37 | 601212, Владимирская обл., Собинский район, п. Колокша |
| 18 | МБОУ “Фетининская ООШ” | муниципальное бюджетное общеобразовательное учреждение “Фетининская основная общеобразовательная школа” Собинского района | Букреева Наталья Львовна, 5-72-30 | 601234, Владимирская обл., Собинский район, с. Фетинино, ул. Суворова, д. 22 |
| Организации дошкольного образования | ||||
| 19 | МБДОУ детский сад № 3 “Лучик” | муниципальное бюджетное дошкольное образовательное учреждение Собинского района детский сад № 3 “Лучик” | Журавлева Светлана Викторовна, 2-51-84 | 601204, Владимирская обл. , г. Собинка, ул. Чайковского, д. 6 |
| 20 | МБДОУ детский сад № 4 “Золотой ключик” | муниципальное бюджетное дошкольное образовательное учреждение Собинского района детский сад № 4 “Золотой ключик” | Филипова Валентина Владимировна, 2-51-39 | 601204, Владимирская обл., г. Собинка, ул. Ленина, д. 17 |
| 21 | МБДОУ детский сад № 6 “Радуга” | муниципальное бюджетное дошкольное образовательное учреждение Собинского района детский сад №6 “Радуга” | Заварзина Марина Александровна, 2-51-67 | 601204, Владимирская обл., г. Собинка, ул. Парковая, д. 36-а |
| 22 | МБДОУ детский сад № 8 “Росинка” | муниципальное бюджетное дошкольное образовательное учреждение Собинского района детский сад № 8 “Росинка” общеразвивающего вида с приоритетным осуществлением деятельности по познавательно-речевому направлению развития детей | Познухова Елена Геннадьевна, 2-29-37 | 601202, Владимирская обл. , г. Собинка, ул. Гагарина, д. 12 |
| 23 | МБДОУ детский сад № 10 “Улыбка” | муниципальное бюджетное дошкольное образовательное учреждение Собинского района детский сад № 10 “Улыбка” комбинированного вида | Сизова Людмила Алексеевна, 2-51-57 | 601203, Владимирская обл., г. Собинка, ул. Рабочий проспект, д. 16 |
| 24 | МБДОУ детский сад № 5 “8 Марта” | Муниципальное бюджетное дошкольное образовательное учреждение Собинского района детский сад № 5 “8 Марта” присмотра и оздоровления |
Манухина Наталья Сергеевна, 4-15-76 |
601243, Владимирская обл., Собинский район, г. Лакинск, ул. Кирова, д. 4 |
| 25 | МБДОУ детский сад № 11 “Ласточка” | муниципальное бюджетное дошкольное образовательное учреждение Собинского района детский сад № 11 “Ласточка” общеразвивающего вида с приоритетным осуществлением деятельности по художественно-эстетическому направлению развития детей | Кучакова Инна Евгеньевна, 4-16-39 | 601240, Владимирская обл. , Собинский район, г. Лакинск, ул. Горького, д. 29-а |
| 26 | МБДОУ детский сад № 12 “Ромашка” | муниципальное бюджетное дошкольное образовательное учреждение Собинского района детский сад № 12 “Ромашка” общеразвивающего вида с приоритетным осуществлением деятельности по художественно-эстетическому направлению развития детей | Горохова Наталья Вячеславовна, 4-17-55 | 601243, Владимирская обл., Собинский район, г. Лакинск, ул. Зелёная, д. 16 |
| 27 | МБДОУ детский сад № 14 “Золотая рыбка” | муниципальное бюджетное дошкольное образовательное учреждение Собинского района детский сад № 14 “Золотая рыбка” | Цыкулаева Нина Анатольевна, 4-12-72 | 601240, Владимирская обл., Собинский район, г. Лакинск, ул. Текстильщиков, д. 3 |
| 28 | МБДОУ детский сад № 15 “Солнышко” | муниципальное бюджетное дошкольное образовательное учреждение Собинского района детский сад № 15 “Солнышко” общеразвивающего вида с приоритетным осуществлением деятельности по физическому направлению развития детей | Мешкова Дарья Алексеевна, 4-17-53 | 601241, Владимирская обл. , Собинский район, г. Лакинск, ул. Мира, д. 59-а |
| 29 | МБДОУ детский сад № 16 “Радость” | муниципальное бюджетное дошкольное образовательное учреждение Собинского района детский сад № 16 “Радость” общеразвивающего вида с приоритетным осуществлением деятельности по познавательно-речевому направлению развития детей | Белова Ирина Ильинична, 4-18-10 | 601241, Владимирская обл., Собинский район, г. Лакинск, ул. Лермонтова, д. 37 |
| 30 | МБДОУ детский сад № 17 “Родничок” | муниципальное бюджетное дошкольное образовательное учреждение Собинского района детский сад № 17 “Родничок” общеразвивающего вида с приоритетным осуществлением деятельности по художественно-эстетическому направлению развития детей | Ивахненко Елена Алексеевна, 4-13-00 | 601241, Владимирская обл., Собинский район, г. Лакинск, ул. Лермонтова, д. 45 |
| 31 | МБДОУ детский сад № 2 “Вишенка” | муниципальное бюджетное дошкольное образовательное учреждение Собинского района детский сад № 2 “Вишенка” | Врио заведующего Дубова Татьяна Александровна, 5-26-32 | 601221, Владимирская обл. , Собинский район, п. Ставрово, ул. Кирова, д. 4-а |
| 32 | МБДОУ детский сад № 3 “Улыбка” | муниципальное бюджетное дошкольное образовательное учреждение Собинского района детский сад № 3 “Улыбка” общеразвивающего вида с приоритетным осуществлением деятельности по художественно-эстетическому направлению развития детей | Врио заведующего Фачкова Татьяна Витальевна, 5-11-57 | 601221, Владимирская обл., Собинский район, п. Ставрово, ул. Совхозная, д. 7-а |
| 33 | МБДОУ детский сад № 4 “Колосок” | муниципальное бюджетное дошкольное образовательное учреждение Собинского района детский сад № 4 “Колосок” | Таракашова Валентина Николаевна, 5-22-73 | 601220, Владимирская обл., Собинский район, п. Ставрово, ул. Юбилейная, д. 6-а |
| 34 | МБДОУ детский сад № 5 “Березка” | муниципальное бюджетное дошкольное образовательное учреждение Собинского района детский сад № 5 “Березка” присмотра и оздоровления | Овчинникова Валентина Ивановна, 5-24-50 | 601220, Владимирская обл. , Собинский район, п. Ставрово, ул. Школьная, д. 2-а |
| 35 | МБДОУ детский сад № 8 “Светлячок” | муниципальное бюджетное дошкольное образовательное учреждение Собинского района детский сад № 8 “Светлячок” | Гаришина Жанна Владимировна , 5-57-17 | 601235, Владимирская обл., Собинский район, с. Черкутино, ул. В.А. Солоухина, д. 24 |
| 36 | МБДОУ детский сад № 9 “Родничок” | муниципальное бюджетное дошкольное образовательное учреждение Собинского района детский сад № 9 “Родничок” | Зеленова Галина Викторовна, 3-42-38 | 601215, Владимирская обл., Собинский район, д. Вышманово, ул. Сысоевская, д. 7 |
| 37 | МБДОУ детский сад № 10 “Теремок” | муниципальное бюджетное дошкольное образовательное учреждение Собинского района детский сад № 10 “Теремок” общеразвивающего вида с приоритетным осуществлением деятельности по познавательно-речевому направлению развития детей | Авдеенко Светлана Витальевна, 5-52-30 | 601214, Владимирская обл. , Собинский район, с. Бабаево, ул. Молодёжная, д. 7 |
| 38 | МБДОУ детский сад № 11 “Колокольчик” | муниципальное бюджетное дошкольное образовательное учреждение Собинского района детский сад № 11 “Колокольчик” | Денисова Елена Семёновна, 3-76-38 | 601212, Владимирская обл., Собинский район, п. Колокша, ул. Советская, д. 11 |
| 39 | МБДОУ детский сад № 13 “Василек” | муниципальное бюджетное дошкольное образовательное учреждение Собинского района детский сад № 13 “Василек” | Таушева Наталья Анатольевна, 3-62-66 | 601223, Владимирская обл., Собинский район, д. Курилово, ул. Молодёжная, д. 9 |
| 40 | МБДОУ детский сад № 15 “Колосок” | муниципальное бюджетное дошкольное образовательное учреждение Собинского района детский сад № 15 “Колосок” | Лосева Татьяна Александровна, 5-53-44 | 601232, Владимирская обл. , Собинский район, с. Рождествено, ул. Порошина, д. 12 |
| 41 | МБДОУ детский сад № 18 “Колокольчик” | муниципальное бюджетное дошкольное образовательное учреждение Собинского района детский сад № 18 “Колокольчик” | Яровая Вера Васильевна, 5-75-80 | 601225, Владимирская обл., Собинский район, д. Толпухово, ул. Молодёжная, д. 17 |
| 42 | МБДОУ детский сад № 19 “Лесная сказка” | муниципальное бюджетное дошкольное образовательное учреждение Собинского района детский сад № 19 “Лесная сказка” | Врио Фомина Марина Геннадьевна, 6-91-92 | 601246, Владимирская обл., Собинский район, с. Заречное, ул. Парковая, д. 13 |
| 43 | МБДОУ детский сад № 20 “Теремок” | муниципальное бюджетное дошкольное образовательное учреждение Собинского района детский сад № 20 “Теремок” | Приходько Любовь Михайловна, 3-22-98 | 601211, Владимирская обл. , Собинский район, с. Ворша, ул. Молодёжная, д. 16 |
| 44 | МБДОУ детский сад № 22 “Ручеек” | муниципальное бюджетное дошкольное образовательное учреждение Собинского района детский сад № 22 “Ручеек” | Браилян Лариса Ивановна, 5-65-34 | 601211, Владимирская обл., Собинский район, с. Волосово, ул. Мичуринская, д. 9а |
| Организации дополнительного образования | ||||
| 45 | МБУ ДО ЦДО г. Собинки |
муниципальное бюджетное учреждение дополнительного образования Собинского района центр дополнительного образования |
Михайлова Ирина Александровна, 2-25-67 | 601204, Владимирская обл., Собинский район, г. Собинка, ул. Димитрова, д. 24-а |
| 46 | МБУ ДО ДПЦ г. Лакинска | муниципальное бюджетное образовательное учреждение дополнительного образования детей Собинского района Детский (подростковый) центр г. Лакинска |
Букина Наталья Вячеславовна, 4-13-07 | 601240, Владимирская обл., Собинский район, г. Лакинск, ул. Текстильщиков, д. 9 |
СобинкиАдминистрация поселка Ставрово | Трутнева Нина Петровна
Трутнева Нина Петровна родилась в семье учителя, где царила атмосфера добра и заботы о детях. Родители воспитали 6 педагогов. С самого детства у нее появилось желание стать учителем. В 1955 году она поступила во Владимирский Педагогический институт на филологический факультет. В 1957-м году в составе студенческого отряда ездила на уборку целинного урожая в Казахстан. В 1960 году по направлению начала работу учителем русского языка и литературы в средней школе п. Степановка Татарского района Новосибирской области. В 1962 году вернулась на Владимирскую землю- в Калитеевскую восьмилетнюю школу. Нина Петровна являлась активным жителем села, проводила образовательные занятия с родителями и работниками колхоза. В 1964 году кандидатура Нины Петровны была утверждена на должность заместителя секретаря Ставровского комитета ВЛКСМ.
С 1965 году ее назначают директором Калитеевской 8-летней школы, где проработала она до 1971 года. В 1971 году Нина Петровна с семьей переезжает в п. Ставрово и работает в Ставровской средней школе учителем русского языка и литературы.
В марте 1977 года Трутневу Нину Петровну назначили директором новой, еще строящейся школы на 960 посадочных мест. Молодому директору совместно с работниками Ставровского завода АТО приходилось контролировать своевременность и качество сдаваемого здания школы. 7 февраля 1978 года новая школа, еще с запахом свежей краски, распахнула свои двери для учеников п. Ставрово. Постепенно обживалась школа мебелью и наглядными пособиями, благоустраивалась и озеленялась территория. Численность населения поселка стремительно росла, рождались дети, школе пришлось перейти на режим двухсменной работы. В 1983 году решением Администрацией Собинского района и администрацией Ставровского завода АТО утверждается смета на строительство пристройки к школе на 270 мест.
В 1989 году второе здание было введено в эксплуатацию. Совместно с учителями и родителями были организованы субботники и воскресники по устройству помещений и территории начальной школы. На пришкольном участке и в теплице проводилась большая опытническая работа, несколько раз Ставровская школа №1 была участницей ВДНХ, систематически занимала призовые места в районе и в области, участвуя в смотрах и соревнованиях. Большое внимание коллектив школы уделял трудовому воспитанию молодежи, мастерская была оборудована различными станками, мальчики получали профессию тракториста. Школа полностью была обеспечена современными техническими средствами. В 1987 году первой из района школа была оснащена компьютерным классом. Выпускники подтверждали свои знания при поступлении в различные Вузы страны. Трутнева Нина Петровна сформировала коллектив грамотных профессиональных педагогов, товарищей с активной жизненной позицией. Благодаря слаженной, подвижнической работе учителей с родителями и детьми, успешно решались многие вопросы учебно-воспитательного процесса.
Педагогическое мастерство, простота и скромность, высокая требовательность к себе и окружающим, большая любовь к детям, забота об укреплении их здоровья, умение в любую минуту помочь людям добрым словом создали ей заслуженный авторитет в поселке.
В течение 23 лет Трутнева Нина Петровна была директором, из них 17 лет возглавляла Ставровскую среднюю школу №1. Трудовой педагогический стаж работы 40 лет. Жителями района и поселка на протяжении 4 созывов (20 лет)Трутнева Нина Петровна была избрана в депутаты районного Совета народных депутатов.
За высокий благородный труд, за активное участие и успехи, достигнутые во Всероссийском социалистическом соревновании автономных республик, краев, областей, округов, городов, районов за лучшую подготовку школ к 1983-84гг., Нина Петровна была награждена «Почетной грамотой Министерства просвещения РСФСР» г.Москва 24.01.1984г, медалью «За добросовестный труд» 1970г., значком «Отличник народного просвещения РСФСР» 1985год, имеет многочисленные грамоты Департамента образования Владимирской области, отдела образования администрации Собинского района.
Выпускники школы постоянно поддерживают с Трутневой Ниной Петровной тесную связь, обращаются за советами, делятся своими успехами и неудачами.
Любовь к делу, настойчивость и терпение, скромность и простота помогают ей преодолевать трудности. Свою жизнь Нина Петровна посвятила детям поселка Ставрово.
Трутнева Нина Петровна с мужем Трутневым Владимиром Михайловичем воспитала троих детей, 6 внуков.
Трутнева Нина Петровна является представителем династии учителей Крыловых-Трутневых, которая насчитывает более 600 лет педагогического общего стажа.
Трутнева Нина Петровна- патриот своей малой Родины.
Дата создания: 21-02-2019
Дата последнего изменения: 17-03-2020
школы в Собинском районе Владимирской области
школы с адресами фото и официальным сайтом в Собинском районе Владимирской области на vgv|
Наука и Образование: школы
Асерховская Средняя школа Асерхово п. Если Вашей организации нет в разделе – школы в Собинском районе Владимирской области , исправьте и дополните информацию , или пришлите в произвольном виде информацию на E-mail [email protected] , единственое обязательное условие контактная информация лица приславшего информацию ФИО тел. и E-mail , ( данная информация не публикуется и нужна для подтверждения достоверности информации ) Вся размещенная в интернет энциклопедии «Виртуальный город Владимир» информация в разделе – школы в Собинском районе Владимирской области, создана авторами Виртуального Владимира,получена от пользователей, или взята из открытых источников, и носит исключительно информационный характер и не является публичной офертой.Вся размещенная в интернет энциклопедии «Виртуальный город Владимир» информация Ни при каких обстоятельствах администрация сайта VGV не несет ответственности за ущерб, убытки или расходы, возникшие в связи с использованием опубликованной информации или невозможностью её использования. Статус VGV «Общественное достояние» Автор – Сергей Королев г.Владимир 2001-2021 гг. |
Евгений Ставровский: «В «Сочи» – талантливая молодежь и качественные легионеры. Настроены оптимистично, нужно время» – Новости хоккея
ВИДИМ РЕЗЕРВЫ В ТАКТИКЕ И “ФИЗИКЕ”
– Вы дебютировали в КХЛ матчами с “Амуром” (3:4 Б) и “Салаватом Юлаевым” (0:2). Какие впечатления – от клуба и от Лиги?
– В первой игре чувствовал нервозность, вторая прошла в рабочем режиме, адаптация состоялась. Об уровне КХЛ, ведущей Лиги Европы, много говорить не надо, что касается ХК “Сочи”, то нашей команде, несмотря на результат, больше удалась встреча с Уфой.
Именно в этом матче хоккеисты ухватили те моменты, которые предложил тренерский штаб. Сыграли активно, во многих эпизодах навязывали свой хоккей сопернику, перехватывали его атаки еще в средней зоне, выигрывали пространство. Благодарен команде за такой прогресс.
– Что бросилось в глаза на первых тренировках с “Сочи”?
– Два момента. Первый – крайне среднее функциональное состояние команды. Второй – тот достаточно консервативный хоккей, к которому команда привыкла, в том числе на тренировках.
В штабе “Сочи” мы уже решили, что к ноябрю к паузе на Евротур будет разработан корректирующий план подготовки. И функциональной, и тактической. На данном этапе, когда игры идут одна за другой и даже между домашними и гостевыми сериями у нас нет перерыва, возможны только минимальные изменения. Но во время европейской паузы будет несколько дней для полноценного тренировочного процесса, тогда нам станет легче.
При этом хочу подчеркнуть, что все недостатки, связанные в частности с физической формой, абсолютно объективные. Пик эпидемии пришелся на август, по сути, целостной предсезонки у команды не было. Все логично.
МНЕ НРАВИТСЯ РАБОТАТЬ С МОЛОДЫМИ, ИХ НЕ ЗАГНАТЬ В ОБОРОНИТЕЛЬНЫЕ СХЕМЫ
– Вы – новичок в КХЛ, болельщикам интересна ваша тренерская философия…
– До работы в тренерском штабе “Северстали” трудился в юниорской сборной России U-17, отвечал в ней за линию нападения, у нашей команды было много результативных матчей. Мне нравится работа с молодыми, нравится атакующий хоккей. Иначе, впрочем, и быть не может – молодых не загнать в жесткие оборонительные схемы, они всегда хотят нападать (улыбается).
В “Сочи” – одна из самых молодых команд Лиги, поэтому мы обязаны играть в более атакующий и мобильный хоккей – естественно, правильно обороняясь. Но без полноценного функционального фундамента такой хоккей не покажешь.
– Что скажете о молодежи ХК “Сочи”?
– До своего назначения знал многих талантов клуба. Но когда работаешь с молодежью, нужно быть крайне осторожным в оценках, в комплиментах, поскольку в силу возраста “звездная болезнь” ходит с нами рядом.
В прессе уже много говорилось о потенциале защитников Мироманова и Седова, форвардов Рубцова, Глотова, Огирчука, могу назвать еще фамилии – например, Гараева и Петькова. Но необходимо понимать, что все они состоятся в хоккее только при большой и ежедневной работе. И – подчеркну – при правильной работе, что в первую очередь зависит от тренерского штаба.
РАБОТА РЯДОМ СО СТРЕМВАЛЛЕМ И Ко МНОГОЕ ДАЕТ НАШЕЙ МОЛОДЕЖИ
– Линию легионеров “Сочи” – вратаря Лассинантти, защитника Рундблада, форвардов Нильссона, Карьялайнена и Стремвалля порой критикуют. Покритикуете и вы?
– Уровень наших легионеров не вызывает сомнений, но нужно учитывать, что большинство из них дебютирует в КХЛ, необходима адаптация. Именно с этим связываю то, что, например, лучшим бомбардиром “Сочи” в сезоне является защитник – Мироманов. Безусловно, правильнее в этой роли увидеть все-таки более опытных игроков, форвардов, легионеров…
Хочу подчеркнуть, что базовое мастерство у Стремвалля и Ко на высоком уровне, в тренировочном процессе работа рядом с ними многое дает нашей молодежи. В истории КХЛ много примеров совместного роста именно легионеров и молодых, мы тоже намерены идти по этой дороге.
Кстати, возвращаясь к легионерам, могу сказать, что по итогам голосования болельщиков на сайте “Сочи” лучшим игроком матча с “Салаватом” признан вратарь Лассинантти. Хоккей – командная игра, в которой нет смысла никого выделять, но мнение болельщиков штабу “Сочи” интересно.
В СЛАБОМ КЛУБЕ КАНДИДАТОВ В СБОРНУЮ НЕ ВЫРАСТИШЬ
– Спортивный директор “Сочи” Андрей Зюзин недавно в интервью сказал, что одна из задач клуба на перспективу – предлагать во время каждой паузы на Евротур национальной и олимпийской сборным России до пяти кандидатов. Что скажете?
– Мы обсуждали все эти моменты в штабе, они входят в концепцию ХК “Сочи”. У нас есть потенциал решать такую задачу, воспитание игроков для сборных – одна из основных целей любого клуба КХЛ.
При этом всем нашим штабом прекрасно понимаем, что в слабом клубе молодые на постоянной основе расти не будут. Поэтому прежде всего должны выправлять свою турнирную позицию в КХЛ и подтягиваться в зону плей-офф.
– Эта задача в сезоне-2020/21 для ХК “Сочи” – реальная?
– Сейчас до кубковой отметки нам не хватает трех-четырех побед. На дистанции в сорок с лишним матчей такой гандикап отыгрывается.
Мы настроены оптимистично, в “Сочи” перспективная молодежь, крепкие ветераны и качественные легионеры. Если в ближайшее время подтянем моменты с “физикой” и тактикой, то кубковая гонка никуда от нас не денется.
Russia-Hockey.ru
Фото: hcsochi.ru
Средняя школа Стэнборо | Творчески развивающиеся мировые лидеры в безопасной среде обучения, основанной на ценностях.
Stanborough – это независимая христианская школа совместного обучения, которая уникальна своим разнообразным набором учеников и индивидуальным подходом к обучению. Мы преподаем по широкой и сбалансированной учебной программе, рассчитанной на удовлетворение потребностей учащихся любого происхождения, включая учащихся из неблагополучных семей и учащихся с особыми образовательными потребностями. Многие из наших учеников поступают в школу Стэнборо ниже национальных ожиданий и уезжают, добившись отличных успехов, что позволяет получить отличные результаты GCSE.
Академическая строгость – основа для нас в Стэнборо. Однако мы увлечены гораздо большим, чем это. Нам нравится видеть, как молодые люди понимают свою ценность, учатся уважать и поощрять других и вносить свой вклад в более широкое школьное сообщество. Родители, решившие отправить своих детей в Стэнборо, признают приверженность школы к академическим успехам, ценят веру школы в разумные моральные ценности и ее выдающуюся пастырскую заботу. Они ценят семейную атмосферу в школе и то богатство, которое заключается в ее счастливых и уравновешенных учениках.
Небольшие классы и отличная пастырская забота позволяют нам бросать вызов и поддерживать каждого человека в его обучении и развитии хороших навыков межличностного общения. Наши ценности совершенства, уважения, мужества и стойкости позволяют молодым людям расти в уверенности и ценить друг друга.
Наша философия, воплощенная в нашем девизе (Бог – Мастер нашей школы), сформировала многие поколения семей, получивших образование в Стэнборо с 1919 года. Христианские корни школы делают ее привлекательной для учеников всех вероисповеданий и происхождения со всех уголков страны. Мир.Прошлые студенты сделали различные выдающиеся карьеры в бизнесе, образовании, юриспруденции, медицине и теологии.
Школа расположена на территории прекрасного парка площадью более 40 акров, всего в 30 минутах езды от Лондона и представляет собой идеальные условия для обучения.
Этот веб-сайт даст вам представление об образовании, возможностях и проблемах, которые школа может предложить вашему ребенку. Пожалуйста, внимательно изучите его, и я надеюсь, что он пробудит аппетит к посещению, во время которого, я уверен, вы получите реальное ощущение энергии, счастья и участия в обучении наших детей.Я также уверен, что вы поймете, почему мы так гордимся ее местоположением, наследием, удобствами и персоналом школы, но, прежде всего, детьми, которые определяют нас и являются сердцем школы.
Ингибиторы высвобождения цитохрома с с терапевтическим потенциалом при болезни Хантингтона
Введение
Было ясно продемонстрировано, что высвобождение цитохрома c из митохондрий в цитоплазму приводит к последующей активации каспазы, ведущей к гибели клеток.Общей чертой прогрессирования клеточной гибели является дисфункция митохондрий, которая связана с высвобождением цитохрома c из митохондрий в цитоплазму (Beal, 1999; Bernardi et al., 1999; Zhu et al., 2002; Friedlander, 2003; Wang et al., 2003; Zhang et al., 2003; Chan, 2004). Присутствие цитохрома c в цитоплазме часто обнаруживается после широкого спектра поражений ЦНС во время острой и хронической нейродегенерации (Hengartner, 2000; Rigamonti et al., 2001; Чжу и др., 2002; Фридлендер, 2003; Wang et al., 2003). Цитохром c связывается с Apaf-1 с образованием «апоптосомы». Эта молекулярная сборка также включает прокаспазу-9, белок, который подвергается автокаталитическому протеолизу с образованием зрелой каспазы-9. Этот фермент активирует каспазу-3, которая, в свою очередь, играет важную роль в гибели клеток (Li et al., 1997; Zou et al., 1997). Однако, приведет ли ингибирование высвобождения цитохрома c к нейропротекции in vivo , не было окончательно продемонстрировано.
В предыдущей работе мы продемонстрировали, что миноциклин напрямую ингибирует высвобождение цитохрома c из митохондрий (Zhu et al., 2002). Предположительно, это молекулярное свойство может объяснить широкий спектр нейропротекторных эффектов препарата: он полезен в экспериментальных моделях инсульта, травмы головного и спинного мозга, болезни Хантингтона (HD), бокового амиотрофического склероза (ALS), болезни Паркинсона и рассеянный склероз (Yrjänheikki et al., 1998; Chen et al., 2000; Брундула и др., 2002; Wu et al., 2002; Чжу и др., 2002; Фридлендер, 2003; Wang et al., 2003). Однако проблема в определении того, что именно эта функция (т.е. ингибирование высвобождения цитохрома c ) опосредует его нейропротекторное действие, заключается в том, что миноциклин имеет ряд дополнительных функций, которые потенциально объясняют его защитные свойства. Помимо ингибирования высвобождения цитохрома c , миноциклин прямо или косвенно подавляет реактивный микроглиоз, p38MAPK и поли (ADP-рибозу) полимеразу (Tikka et al., 2001; Wu et al., 2002; Алано и др., 2006). Поэтому, чтобы предоставить дополнительные доказательства физиологической роли высвобождения цитохрома c при HD, мы провели поиск дополнительных лекарств, которые могли бы ингибировать высвобождение цитохрома c , и после этого оценили бы их на моделях HD. Первым шагом в нашей цели по поиску ингибиторов высвобождения цитохрома c является разработка бесклеточного скринингового анализа для выявления лекарств, которые ингибируют высвобождение митохондриального цитохрома c .Батарея потенциальных агентов – это библиотека Консорциума по скринингу лекарственных средств нейродегенерации, состоящая из 1040 соединений, собранная Национальным институтом неврологических расстройств и инсульта (NINDS). Лекарства в этой библиотеке в основном выбираются из тех, которые одобрены для клинического использования Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA). Кроме того, известно, что многие из них проникают через гематоэнцефалический барьер. Эффективность скрининга этой конкретной библиотеки была продемонстрирована в нескольких публикациях ряда независимых лабораторий, определяющих потенциальные новые нейропротективные препараты (Aiken et al., 2004; Ставровская и др., 2004; Ротштейн и др., 2005; W. Wang et al., 2005).
В этом исследовании мы представляем результаты скрининга in vitro с использованием изолированных митохондрий этой библиотеки соединений 1040 для ингибиторов высвобождения цитохрома c . Лекарства, эффективные в бесклеточном анализе, использовали во вторичном скрининге для выявления тех, которые являются защитными в линиях нейронных клеток. Перспективные совпадения были оценены на мутантных клетках полосатого тела ST14A хантингтина (htt). Один из эффективных препаратов, метазоламид, был выбран для дальнейшей углубленной оценки.Во время испытаний на модели трансгенных мышей было доказано, что метазоламид задерживает начало заболевания и смертность, а также гистологические маркеры нейродегенерации хронического нейродегенеративного синдрома, напоминающего HD. Наши результаты демонстрируют, что методы митохондриального скрининга полезны для идентификации агентов, которые являются нейропротективными, и предоставляют дополнительные доказательства in vivo для функциональной роли высвобождения цитохрома c при HD.
Результаты
Скрининг ингибиторов цитохрома
c высвобождения из очищенных митохондрийДля поиска ингибиторов высвобождения цитохрома c мы разработали бесклеточный скрининговый анализ для идентификации лекарств, которые ингибируют высвобождение цитохрома c из митохондрий печени мыши.Изолированные митохондрии предварительно инкубируют с исследуемым препаратом в течение 5 мин. Чтобы вызвать высвобождение цитохрома c , органеллы обрабатывают 20 мкм Ca 2+ в течение 30 минут при 37 ° C. После удаления митохондрий центрифугированием супернатант анализируют с помощью ELISA для определения концентрации цитохрома c . Эта процедура была использована для тестирования всех 1040 соединений в библиотеке, собранной Консорциумом нейродегенерации наркотиков NINDS. Многие из этих молекул проникают через гематоэнцефалический барьер, и большинство из них одобрены Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA), уже применяемыми в клинической практике.
Эксперименты проводились «двойным слепым» методом наблюдателями, не знавшими идентичность каждого препарата. Рисунок 1 A показывает распределение активности среди 80 соединений, нарушающих один из 13 «наборов», составляющих библиотеку. Аналогичные данные были собраны для 12 других наборов. Для создания Фигуры 1 B данные для каждого из этих 13 наборов соединений нормализованы так, чтобы среднее значение в каждом наборе было одинаковым. Сгенерированные таким образом цветные кривые затем суммируются, чтобы сформировать большое распределение, охватывающее всю библиотеку NINDS (рис.1, сплошная черная линия). Большинство лекарств мало влияют на высвобождение цитохрома c в ответ на стимуляцию Ca 2+ . Однако есть некоторые особенности, указывающие на лекарства, которые существенно стимулируют или, что более важно, ингибируют высвобождение цитохрома c .
Рисунок 1.Cytochrome c Высвобождение из очищенных митохондрий по-разному зависит от различных соединений в библиотеке NINDS. A , Это распределение построено на основе измерений воздействия каждого лекарства на высвобождение цитохрома c .Данные собираются по 80 соединениям (т.е. по всему комплекту набора 6). Координата x на этом графике является мерой высвобождения цитохрома c из митохондрий, стимулированных Ca 2+ . Ось x разделена на интервалы, по 20 на смену 1 нг / мл. Координата y – это количество событий, попадающих в каждую такую ячейку. Зеленой линией отмечен уровень высвобождения цитохрома c при стимуляции ионами Ca 2+ , но в отсутствие других фармакологических агентов.Соединения, отмеченные справа от зеленой линии, стимулируют высвобождение цитохрома c ; те, что указаны слева, тормозят процесс. Синяя линия соответствует уровню высвобождения цитохрома c в отсутствие ионов Ca 2+ . Красная линия представляет собой уровень митохондрий, стимулированных Ca 2+ , в присутствии циклоспорина A. B . Цветные кривые представляют собой эквивалентные распределения для каждого из 13 наборов. Измерения в каждом наборе соединений нормализованы, что позволяет получить распределения с идентичными средними значениями.Черная линия – это сумма этих 13 распределений. Пунктирная линия на 1,5 SD меньше среднего значения для большого распределения. Ось x снова разделена на интервалы, каждый из которых охватывает 1/20 единичного расстояния от нуля до нормированного среднего. Координата y – это количество измерений среди всех 1040, попадающих в рассматриваемый интервал. C . После ранжирования соединений по их эффективности при ингибировании высвобождения цитохрома c был выбран 21 из них.Эти потенциально терапевтические молекулы не только сильно влияют на тестируемые митохондрии, они, как известно, преодолевают гематоэнцефалический барьер и могут безопасно вводиться пациентам. Все они используются в клинической практике, каждый в указанной мощности. NCC, Национальный институт неврологических заболеваний и индивидуальная коллекция инсультов.
Чтобы выбрать потенциально нейрозащитные соединения, мы выбрали те, которые подавляют высвобождение цитохрома c на> 1,5 SD ниже среднего значения общего распределения (т.е., слева от пунктирной линии). В ходе первичного скрининга было обнаружено, что 48 соединений подавляют высвобождение цитохрома c ниже этого значения. На втором экране 39 лучших кандидатов подтвердили свою эффективность при наличии на 10 и 20 мкм (данные не показаны). Затем мы выбрали среди них на основе их текущего клинического использования и общего рейтинга на приведенном выше экране. Кроме того, все препараты, вызывающие серьезные побочные эффекты, и те, которые исключены из ЦНС через гематоэнцефалический барьер, были удалены, в результате осталось 21 соединение (рис.1 С ). Таким образом, наш бесклеточный анализ сузил список соединений для исследования в живых клетках до <2% от исходного списка из 1040. Мы отмечаем, что миноциклин является вторым наиболее сильнодействующим лекарством, идентифицированным с использованием этого протокола, а связанный с ним антибиотик доксициклин занимает седьмое место. .
Ингибиторы цитохрома
c высвобождения защищают культивируемые клеткиЖивые клетки намного сложнее митохондрий; Поэтому мы протестировали в клеточной системе 21 соединение, которое наиболее сильно ингибирует высвобождение цитохрома c из очищенных митохондрий.В этом эксперименте каждое потенциально нейропротекторное лекарство использовалось для лечения мутантных-htt-экспрессирующих клеток ST14A, клеточной модели HD (Rigamonti et al., 2000; Wang et al., 2003; X. Wang et al., 2005), и один, в котором высвобождение цитохрома c , как известно, стимулирует процесс гибели клеток (Rigamonti et al., 2001; Wang et al., 2003). Стимул, используемый для индукции гибели клеток, сдвигает чувствительные к температуре клетки с 33 ° C (допустимая температура) до 37 ° C (недопустимая температура) в среде без сыворотки (Rigamonti et al., 2000; Wang et al., 2003; X. Wang et al., 2005), что вызывало ~ 40% гибели клеток в мутантных клетках HTT14A в качестве положительного контроля и ~ 18% гибели клеток в родительских клетках ST14A в качестве отрицательного контроля с помощью анализа MTS в нашем ранее опубликованном исследовании (X. Wang et al., 2005).
Чтобы определить относительную эффективность этих препаратов, мы измерили степень гибели клеток в зависимости от концентрации препарата. Каждое лекарство тестировали при 7–10 концентрациях с помощью теста MTS. Полученные кривые (построенные полулогарифмически) определяют IC 50 и максимальную защиту, обеспечиваемую каждым соединением (рис.2) (дополнительная таблица S1, доступна на www.jneurosci.org в качестве дополнительных материалов). Кривые доза-ответ для 21 препарата можно разделить на три широкие категории: соединения в группах I и II снижают гибель клеток, вызванную изменением температуры. Те в группе I активны при более низких концентрациях, чем в группе II, имея значения для IC 50 в наномолярном диапазоне. Однако они токсичны при более высоких концентрациях (рис. 2 A ). Соединения группы II ингибируют гибель клеток в широком диапазоне концентраций, но они имеют значения IC 50 в микромолярном диапазоне (рис.2 В ). Кроме того, прямое измерение гибели клеток с помощью анализа исключения красителя трипанового синего при максимально эффективной концентрации каждого соединения обеспечивает аналогичную нейрозащиту (дополнительный рисунок 2, доступный на www.jneurosci.org в качестве дополнительного материала), таким образом подтверждая результаты исследования МТС пробирный.
Фигура 2.Анализ 21 отобранного соединения на их способность спасать культивируемые клетки. Клетки полосатого тела мутант-htt ST14A смещаются до 37 ° C (недопустимая температура) в SDM, чтобы вызвать гибель клеток.Исследуемый препарат присутствует в среде (кроме контрольной культуры) в течение 2 ч до температурного сдвига и еще 18 ч после него. Относительная степень гибели клеток оценивается с помощью анализа внутренней соли MTS. Гибель клеток, вызванная изменением температуры в SDM, определяется как 100%. Относительный процент гибели клеток в результате инкубации различных концентраций исследуемого лекарственного средства при изменении температуры в SDM регистрируется как относительная гибель клеток. Включая безмедикаментозный контроль, всего проведено 22 анализа.Во всех случаях клетки оценивали в шести повторах, каждую в одном слоте 96-луночного планшета, и тестировали с помощью автоматического считывателя планшетов. Вся эта экспериментальная программа была независимо повторена три раза. Каждая точка данных соответствует среднему значению ± стандартное отклонение результатов 18 испытаний (дополнительная таблица S1, доступная на сайте www.jneurosci.org в качестве дополнительного материала). Результаты отображаются графически на этом рисунке. Соединения подразделяются на три категории в соответствии с их максимальной эффективностью в предотвращении гибели клеток и IC 50 для этой активности. A , Соединения группы I являются защитными в наномолярном диапазоне. B , Соединения группы II являются защитными в микромолярном диапазоне. C , Соединения группы III не являются защитными (а иногда и токсичными). Эта классификация уместна, что становится очевидным после ознакомления с табличными параметрами.
Напротив, соединения группы III, хотя и активны в очищенных митохондриях, не проявляют значительного ингибирования гибели клеток (рис.2 С ). Примечательно, что три соединения в группе I (фендилин гидрохлорид, ритансерин и бепридил гидрохлорид) и соединение меклизина гидрохлорид группы III содержат два фенильных кольца и один положительно заряженный центр (азот) (дополнительный рисунок S1, доступный на сайте www.jneurosci). .org в качестве дополнительного материала). Этот структурный мотив напоминает часть тетрафенилфосфония, соединения, которое, как известно, локализуется в митохондриях.
Мы обнаружили, что четыре соединения из группы I имеют особые перспективы в качестве потенциально нейропротективных препаратов.IC 50 для этих соединений особенно низок, и они обеспечивают надежную защиту при насыщающей концентрации. Это фендилин гидрохлорид, кальцимицин, дипирон и бепридил гидрохлорид, соединения с IC 50 7, 7, 15 и 128 нм соответственно. Ритансерин и азатиоприн вряд ли окажутся нейропротекторными, потому что они не могут обеспечить даже 30% защиты, когда присутствуют в насыщающих концентрациях. Тем не менее, их низкие значения IC 50 50 и 124 нм соответственно относят их к группе I (рис.2 А ).
Среди соединений группы II 10 оказались потенциально защищающими от нейродегенерации. Эти соединения представляют собой партенолид (IC 50 , 1,3 мкм), гидроксипрогестерона капроат (2,5 мкм), пробукол (6,6 мкм), метазоламид (9,5 мкм), гидрохлорид доксициклина (12,4 мкм), N -ацетил-dl-триптофан ( 12,6 мкм), миноциклина гидрохлорид (14,4 мкм) и мелатонин (15,5 мкм) (рис. 2 B ). Дицикломин и мефенитоин, еще два препарата группы II, никогда не обеспечивали> 30% защиты культивируемых клеток, что делало их плохими кандидатами на роль препарата с активностью in vivo и .
Остальные пять соединений отнесены к группе III. Они не демонстрируют значительной нейрозащиты, возможно, потому, что обладают внутренней токсичностью (рис. 2 C ). Примером может служить госсиполуксусная кислота. Хотя это единственный наиболее мощный ингибитор высвобождения цитохрома c из очищенных митохондрий (рис. 1), он токсичен для мутантных htt ST14A клеток полосатого тела. Следовательно, он классифицируется как препарат III группы. Будучи бесполезным для терапии in vivo , он является хорошим отрицательным контролем в дальнейших экспериментах.
Среди 21 соединения, ингибирующего высвобождение цитохрома c из изолированных митохондрий, 16 (76%) являются защитными в клеточной модели гибели клеток. Такой высокий уровень успеха подтверждает наше предположение о том, что ингибиторы молекулярного процесса полезны для клеток в культуре. Уже известно, что некоторые из этих соединений защищают от гибели клеток. Дипирон (также известный как метамизол) оказывает антиапоптотическое действие на клеточные линии HL-60, Jurkat и Raji в различных условиях, которые, как известно, вызывают апоптоз (Coimbra et al., 1996; Помпея и др., 2001). Ритансерин, специфический антагонист рецептора серотонина 5-HT2, снижает ишемическое повреждение во время временной глобальной ишемии (Globus et al., 1992). Антиоксидантный пробукол снижает токсичность HgCl 2 (Gassó et al., 2001). Доксициклина гидрохлорид документально подтвердил нейрозащитный эффект (Yrjänheikki et al., 1998). Сообщалось, что метазоламид и мелатонин ( N -ацетил-5-метокситриптамин) предотвращают гибель клеток нейробластомы SH-SY5Y после окислительного повреждения (Sarang et al., 2002). Кроме того, миноциклин защищает от различных острых и хронических заболеваний ЦНС. Миноциклин уменьшает повреждение тканей после ишемии и черепно-мозговой травмы, задерживает начало и увеличивает выживаемость на животных моделях БАС и HD, а также проявляет нейропротекторные свойства в экспериментальных моделях болезни Паркинсона и рассеянного склероза (Yrjänheikki et al., 1998; Chen et al., 2000; Sanchez Mejia et al., 2001; Brundula et al., 2002; Wu et al., 2002; Zhu et al., 2002; Friedlander, 2003; Wang et al., 2003). Однако интересно, что в ряде публикаций не удалось продемонстрировать нейрозащиту, опосредованную миноциклином (Diguet et al., 2003; Smith et al., 2003; NINDS NET-PD Investigators, 2006). Однако в целом нейропротекция, опосредованная миноциклином, была реализована в широком спектре моделей в ряде независимых лабораторий (Yrjänheikki et al., 1999; Chen et al., 2000; Sanchez Mejia et al., 2001; Brundula et al., al., 2002; Wu et al., 2002; Zhu et al., 2002; Friedlander, 2003; Hersch et al., 2003; Wang et al., 2003; Stack et al., 2006).
Ингибирование высвобождения цитохрома
c и активации каспаз способствует нейропротекции метазоламидомЧтобы обеспечить дополнительное подтверждение принципа эффективности нашего экрана, мы выбрали метазоламид для дополнительной углубленной оценки. Метазоламид хорошо переносится пациентами и эффективно проникает через гематоэнцефалический барьер. Метазоламид в настоящее время используется как мочегонное средство у людей, поскольку он одобрен FDA для лечения глаукомы.На молекулярном уровне это неконкурентный ингибитор карбоангидразы (КА). Однако нет сообщений о том, что метазоламид тестировался на предмет его пользы для пациентов с нейродегенеративными заболеваниями. Изучение путей гибели митохондриальных клеток, как каспазозависимых, так и независимых, является многообещающим направлением исследований, поскольку они имеют документально подтвержденное значение для нейродегенерации (Beal, 1999; Li et al., 2001; Yu et al., 2002; Zhu et al. al., 2002; Friedlander, 2003; Wang et al., 2003; Zhang et al., 2003; Чан, 2004). В частности, высвобождение цитохрома c и других апоптогенных факторов из этих органелл запускает последовательное созревание каспазы-9 и каспазы-3, а также события независимой от каспазы гибели клеток. Нарушение этого каскада молекулярных событий должно предотвратить гибель клеток. Эти соображения побудили нас изучить изменения, которые метазоламид влияет на физиологию митохондрий и активацию каспаз. Подтверждением этой аргументации является наше предыдущее наблюдение, что нейропротекторное свойство миноциклина является результатом его способности подавлять именно эти молекулярные изменения (Zhu et al., 2002; Wang et al., 2003; Zhang et al., 2003).
Мутантная клеточная линия htt ST14A представляет собой полезную систему для проведения вышеуказанных исследований. Поскольку эти условно иммортализованные клетки полосатого тела несут ген для чувствительного к температуре большого Т-антигена SV40 и еще один ген, кодирующий полиглутамин-расширенный хантингтин, они подвергаются клеточной гибели при переводе в недопустимую температуру 37 ° C (Rigamonti et al., 2000; Wang и др., 2003). Локализацию цитохрома c оценивали иммуноцитохимическим методом с использованием флуоресцентного микроскопа и программного обеспечения для деконволюции.Клетки метили антицитохромом c (фиг. 3 A , вверху, зеленый) и митохондриальным маркером, MitoTracker (фиг. 3 A , посередине, красный). Объединенные изображения демонстрируют локализацию иммунореактивности цитохрома c с митохондриями (рис. 3 A , внизу). Стрелки указывают на высвобождение цитохрома c из митохондрий в цитоплазму, о чем свидетельствует более диффузная картина окрашивания (рис. 3 A ). Метазоламид ингибировал высвобождение цитохрома c , о чем свидетельствует сохранение окрашивания точечных соединений после температурного сдвига (рис.3 А ).
Рисунок 3.Метазоламид подавляет высвобождение митохондриальных апоптогенных факторов и предотвращает активацию каспазы-9 и -3. A , Гибель клеток индуцируется в мутантных клетках полосатого тела htt путем смещения их к недопустимой температуре 37 ° C в SDM. Культуры тестируемых клеток содержат метазоламид 100 мкм, тогда как контроли не содержат этих препаратов. Через 5 ч клетки окрашивают Mitotracker, а затем фиксируют и окрашивают антителами к цитохрому c .Митохондриальный цитохром c демонстрирует точечный рисунок, который колокализуется с Mitotracker. Клетки, в которых высвобождается цитохром c , демонстрируют более диффузное и пониженное окрашивание цитохрома c (стрелки). Метазоламид сохраняет интенсивность и точечные характеристики окраски цитохрома c (шкала 5 мкм). B , Мутантные клетки полосатого тела htt обрабатывают метазоламидом 100 мкм (или обрабатывают в отсутствие метазоламида) в течение 18 часов.Впоследствии они были извлечены; Были получены либо цитозольные компоненты, либо лизаты целых клеток. Образцы, каждый из которых содержит 50 мкг белка, анализировали с помощью вестерн-блоттинга с использованием антител либо к цитохрому c , Smac с цитозольными компонентами, либо к каспазе-9, либо к каспазе-3 с лизатами цельных клеток. β-Актин использовали в качестве контроля нагрузки. Этот блот представляет три независимых эксперимента. ( Легенда к рисунку продолжается .) Денситометрия была проведена для количественной оценки интенсивности полос из трех независимых экспериментов (* p <0.05). C , D , Мутантные https-полосатые клетки обрабатывали метазоламидом 100 мкМ в течение 5 и 18 часов и сравнивали с необработанными контролями. Клетки лизировали, и их совокупную активность каспазы-9 и -3 оценивали с помощью флуорогенного анализа. Результаты представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение трех независимых экспериментов (* p <0,05, ** p <0,001). Экспериментальные контроли включают клетки, обработанные ни стимулом клеточной гибели, ни тестируемыми препаратами (белые столбцы).Другие получают стимул к смерти, но снова не проходят лечение тестируемым препаратом (черные полосы). В дополнение к этим элементам контроля существуют измерения гибели клеток в присутствии метазоламида со стимулом смерти или без него (серые столбцы).
Помимо цитохрома c , Smac / Diablo является проапоптотическим митохондриальным белком, и его высвобождение из митохондрий в цитозоль приводит к ингибированию, способствующей активации каспазы нижестоящего ингибитора белков апоптоза (Du et al., 2000). Вестерн-блоттинг клеточных гомогенатов показывает, что цитоплазматические уровни цитохрома c и Smac / Diablo были повышены при изменении температуры, как и концентрации активной каспазы-3 и -9. Метазоламид подавляет высвобождение митохондриальных апоптогенных факторов и протеолиз прокаспаз (рис. 3 A , B ). В параллельных исследованиях активность каспаз-9 и -3 измеряли по их гидролизу флуорогенных тетрапептидных субстратов. Опять же, обработка клеток метазоламидом ингибировала активацию каспаз (рис.3 C , D ). В совокупности эти наблюдения показывают, что нейрозащита метазоламидом является результатом, по крайней мере частично, ингибирования митохондриально-зависимых путей гибели клеток.
Метазоламид замедляет диссипацию градиента митохондриального потенциала
Метазоламид может обеспечивать цитопротекцию, действуя выше митохондрий, на раннем митохондриальном событии или на более позднем митохондриальном событии, таком как индукция перехода митохондриальной проницаемости (mPT) или высвобождение цитохрома c .Поскольку первоначальный скрининг, который идентифицировал метазоламид, проводился в изолированных митохондриях, наиболее экономная интерпретация заключается в том, что он действует на митохондриальную мишень. Рассеяние электростатического потенциала через внутреннюю митохондриальную мембрану является критическим этапом внутреннего пути апоптоза. После коллапса ΔΨ m органелла может подвергаться mPT, высвобождая апоптогенные факторы в цитоплазму. Воздействие метазоламида на ΔΨ m исследовали с помощью Mitoprobe JC-1 и, независимо, потенциометрического красителя родамина 123.Как обсуждается ниже, мы обнаружили поразительную корреляцию между лечением метазоламидом и сохранением разности потенциалов на внутренней митохондриальной мембране.
Диссипация ΔΨ m , как было обнаружено, сильно коррелирует с повышенной гибелью клеток полосатого тела мутант-htt ST14A, сдвинутых к недопустимой температуре (фиг. 4 A , B ). Независимые исследования с флуоресцентными красителями Mitoprobe JC-1 (рис. 4 A ) и Rh 123 (рис. 4 B ) показали, что метазоламид ингибирует коллапс ΔΨ m .Медикаментозное лечение сохранило красные агрегаты Mitoprobe JC-1 и точечное распределение флуоресценции Rh 123 в присутствии клеточного стресса, свойство, которое коррелирует со способностью соединений снижать степень гибели клеток (Рис.4 A , B ). Напротив, комплекс госсипоил-уксусной кислоты не предотвращал потерю ΔΨ m при индукции гибели клеток полосатого тела мутант-htt ST14A (рис. 4 B ), несмотря на его способность ингибировать высвобождение цитохрома c . из очищенных митохондрий.
Рисунок 4.Метазоламид замедляет рассеяние ΔΨ m , но не ингибирует mPT. A , B , В модели гибели клеток полосатые клетки переносили в SDM и инкубировали в течение 5 или 18 часов при недопустимой температуре. Во время этих проапоптотических обработок в культуральную среду добавляли метазоламид (тестируемые препараты), с одной стороны, или комплекс госсипол-уксусная кислота, или вообще не использовали лекарство (отрицательные контроли), с другой.Затем живые клетки окрашивали либо 5 мкг / мл Mitoprobe JC-1, чтобы измерить коллапс ( Легенда к рисунку продолжается )) электрохимического градиента через митохондриальную мембрану (красные агрегаты JC-1 в здоровых клетках и зеленые JC-1). мономеры в апоптотических клетках) ( A ) или 2 мкм Rh 123 для определения электростатического заряда митохондрий ( B ). C , Метазоламид также исследовали в системе in vitro очищенных митохондрий печени, которые были стимулированы ионами Ca 2+ .Метазоламид не предотвращал индукцию mPT, что оценивалось по динамике набухания митохондрий. Отсутствие такого эффекта при добавлении метазоламида к раствору стимулированных митохондрий проиллюстрировано в C . То же самое верно и для митохондрий, стимулированных несколькими способами (например, ионами Ca 2+ ; Ca 2+ и tBH, PhAsO или Ca 2+ и диамидом). Кривые доза-ответ на эти стимулы практически не изменяются, когда метазоламид присутствует в диапазоне от 0.От 01 мкм до 2 мм. Во всех случаях набухание митохондрий контролируется стандартным спектроскопическим анализом с использованием света 540 нм. D , Митохондрии печени (0,25 мг / мл) активировали с помощью 5 мМ глутамата / малата и инкубировали с 1, 5, 10 и 20 мкМ метазоламида в буфере, содержащем 250 мМ сахарозы, 10 мМ Hepes и 2 мМ KH. 2 PO 4 . Митохондрии заражали болюсным добавлением 5 мкМ Ca 2+ каждые 2 минуты до тех пор, пока не произошло высвобождение секвестрированного Ca 2+ .Аламетицин (100 мкг) добавляли в конце каждого образца. Верхняя левая панель – ΔΨ м , верхняя правая часть находится в буфере, нижняя левая панель – уровень НАДН, а нижняя правая – набухание. Дополнительную информацию см. В разделе «Материалы и методы».
Метазоламид не является ингибитором mPT в изолированных митохондриях
Пора перехода митохондриальной проницаемости состоит из мультимерного комплекса белков, покрывающих внутреннюю и внешнюю мембраны (Crompton et al., 1999; Zoratti et al., 2005).Его открытие является компонентом митохондриальной дисфункции, которое само по себе является результатом таких биохимических стрессов, как высокие концентрации иона Ca 2+ , окислителей, тиол-реактивных соединений (т.е. реактивного альдегида) и проапоптотических цитозольных белков (Ставровская и др., 2004 г.). Потеря ΔΨ m является ранним событием в пути гибели клеток и важным пусковым механизмом каспазного каскада.
Не существует удовлетворительного метода прямого наблюдения за переходом митохондриальной проницаемости в живых клетках.Следовательно, мы исследовали влияние метазоламида на это молекулярное изменение в очищенных митохондриях. В этих экспериментах mPT был индуцирован ионами Ca 2+ , окисляющим агентом, органическим гидропероксидом tBH, тиоловым сшивающим агентом PhAsO, тиоловым окислителем диамидом или их комбинацией (рис. 4 C ). Метазоламид не защищает очищенные митохондрии от этих химических воздействий. Эти наблюдения контрастируют с аналогичными наблюдениями с использованием (1) миноциклина, соединения, которое блокирует потерю потенциала митохондриальной мембраны как in vitro , так и in vivo (Zhu et al., 2002; Wang et al., 2003) или (2) гетероциклические, трициклические или производные фенотиазина агенты (Ставровская и др., 2004). Поскольку его эффекты на очищенные митохондрии различны, метазоламид и миноциклин, вероятно, приносят пользу культивируемым клеткам посредством различных механизмов.
Ни ингибирование mPT, ни прямое воздействие на физиологию митохондрий, по-видимому, не лежат в основе защиты, обеспечиваемой метазоламидом. Первоначальные исследования изолированных митохондрий печени были сосредоточены на мониторинге набухания как маркера или индукции mPT и тестировали агенты в широком диапазоне доза-ответ.Никаких эффектов не наблюдалось, что позволяет предположить, что эти агенты не препятствуют индукции mPT в широком диапазоне концентраций. Поскольку работа в других системах, таких как культивируемые зернистые нейроны мозжечка, показала, что вмешательство в физиологию митохондрий через разобщение и ингибирование дыхания может также оказаться защитным, мы исследовали влияние метазоламида на основные физиологические свойства. Исследования проводились на недавно адаптированной флуоресцентной системе (Баранов и др., 2008), которая позволяет одновременно измерять мембранный потенциал (по флуоресценции TMRM), поток Ca 2+ (с использованием Calcium Green 5N), NAD + / NADH окислительно-восстановительный статус (с использованием автофлуоресценции пары NAD + / NADH) и набухание (через светорассеяние).Система представляет собой усовершенствованный, основанный на флуоресценции аналог электродной системы, которую мы использовали и описывали ранее (Ставровская и др., 2004; Красников и др., 2005). Метазоламид не оказывал значительного воздействия на ΔΨ m , транспорт кальция, окислительно-восстановительный статус NAD + / NADH или набухание (фиг. 4 D ). Метазоламид был связан с немного повышенной чувствительностью к перегрузке Ca 2+ , но можно было бы ожидать, что это, во всяком случае, немного облегчит гибель клеток, а не защитит.Таким образом, данные на рисунке 4, C и D , предполагают, что метазоламид не опосредует свой защитный эффект, воздействуя на базовую физиологию митохондрий, включая митохондриальный окислительно-восстановительный статус и субстрат, транспорт протонов, электронов или Ca 2+ . Эти данные наиболее согласуются с эффектами, опосредованными за пределами внутренней митохондриальной мембраны / митохондриального матрикса, включая потенциальные мишени, такие как члены семейства bcl-2 (например, bax ) и элементы, участвующие в высвобождении проапоптотических белков.Исследования этих потенциальных механизмов продолжаются.
Метазоламид задерживает начало заболевания и смертность у мышей R6 / 2, животная модель хронической нейродегенерации
Мы приступили к исследованию способности метазоламида замедлять хроническую нейродегенерацию. Мыши R6 / 2 были выбраны в качестве животной модели, потому что они страдают нейродегенерацией, напоминающей таковую при HD. Последний синдром является результатом экспрессии человеческого гена, кодирующего N-концевую часть polyQ-расширенного белка хантингтина (Mangiarini et al., 1996). Действительно, мыши R6 / 2 широко используются для изучения новых лекарственных препаратов для лечения заболеваний человека (Ona et al., 1999; Chen et al., 2000; Li et al., 2005; Stack et al., 2006). Начиная с 6-недельного возраста, мыши R6 / 2 получали ежедневные внутрибрюшинные инъекции метазоламида в дозе 20 или 40 мг / кг. Контрольным мышам R6 / 2 вводили физиологический раствор. Вес тела контролировали еженедельно. И тестовая, и контрольная группы состояли из равного количества самцов и самок. Дозозависимым образом лечение метазоламидом значительно задерживало начало заболевания у мышей R6 / 2 на 15 и 27% в группах 20 и 40 мг / кг, соответственно, по сравнению с контрольными группами, получавшими физиологический раствор (рис.5 А – С ). Кроме того, лечение метазоламидом значительно увеличило продолжительность их жизни на 11% (20 мг / кг) и 20% (40 мг / кг) (рис. 5 D ). Однако динамика потери веса существенно не изменилась (рис. 5 C ). Заметная нейрозащита на тканевом уровне наблюдалась у мышей R6 / 2, получавших метазоламид, о чем свидетельствует снижение потери массы мозга (фиг. 6 A ). В соответствии с ослаблением потери массы мозга, общая атрофия головного мозга и двусторонняя гипертрофия желудочков у мышей R6 / 2, получавших физиологический раствор, были значительно снижены у мышей, получавших метазоламид ( F (2,18) = 15.12, p <0,01) (рис.6 B ). Параллельно с этими результатами, введение метазоламида также значительно уменьшило атрофию нейронов полосатого тела у мышей R6 / 2, получавших физиологический раствор (контроль однопометников дикого типа, 136,8 ± 9,8 мкм 2 ; мыши R6 / 2, получавшие метазоламид, 105,7 ± 15,7 мкм 2 ; обработанные физиологическим раствором мыши R6 / 2, 57,4 ± 21,6 мкм 2 , ( F (2,18) = 21,61, p <0,01) (рис. 6 B ). что метазоламид нацелен на высвобождение цитохрома c , мы оценили это событие in vivo .Как и в случае мутантных клеток, экспрессирующих htt, метазоламид значительно ингибировал высвобождение цитохрома c у обработанных мышей R6 / 2 (фиг. 7 A ). Кроме того, поскольку DARP присутствует в нейронах полосатого тела среднего размера, мы провели иммуногистохимический анализ DARP32-иммунопозитивных нейронов у мышей R6 / 2. По сравнению с мышами R6 / 2, которым вводили физиологический раствор, метазоламид заметно снижал потерю иммунореактивных нейронов полосатого тела DARP32 (фиг. 7 B ). Кроме того, хотя раннее и прогрессирующее накопление агрегатов хантинтина является патологическим признаком у мышей R6 / 2, лечение метазоламидом не привело к значительному снижению хантинтин-положительных агрегатов полосатого тела у мышей R6 / 2 (мыши R6 / 2, получавшие физиологический раствор, 5.27 × 10 6 ± 1,18; Мыши R6 / 2, обработанные метазоламидом, 5,06 × 10 6 ± 1,04, ( F (2,12) = 21,61, p <0,22) (фиг.7 C ). Обнаружение отсутствия эффекта от лечения метазоламидом на агрегаты хантинтина аналогично тому, что наблюдали с другими нейропротективными стратегиями (Ona et al., 1999; Chen et al., 2000).
Рисунок 5.Метазоламид задерживает начало нейродегенерации у мышей R6 / 2. A , B , Моторные характеристики мышей R6 / 2 оценивали путем регистрации времени (до 7 мин), в течение которого они оставались на вращающемся стержне со скоростью 15 об / мин ( A ) и 5 об / мин ( B ).Мышам ежедневно вводили 20 или 40 мг / кг метазоламида (или физиологический раствор-носитель) с 6-недельного возраста. Измерения проводили еженедельно, начиная с 6-недельного возраста. Значение p сравнивают с мышами, получавшими физиологический раствор, для метазоламида в дозе 20 мг / кг, p <0,05 на 23, 25 и 27 неделях; для метазоламида 40 мг / кг, p <0,05 на 22, 23, 25 и 26 неделях, p <0,001 на 24, 27 и 28 неделях. C , Масса тела вышеуказанного R6 / 2 мышей регистрировали еженедельно. D . Возраст (в днях) начала заболевания и смерти сведен в таблицу как для животных, получавших лекарственные препараты, так и для контрольных животных. E , Кумулятивная вероятность возникновения дефицита ротарод у мышей R6 / 2. F , Кумулятивная вероятность выживания мышей R6 / 2. Данные о поведении и прогрессировании заболевания были получены на одной и той же когорте мышей. Значение p указано по сравнению с мышами, получавшими физиологический раствор ( n = 12 для группы, получавшей метазоламид в дозе 20 мг / кг; n = 7 для группы, получавшей 40 мг / кг метазоламида; n = 18 для контроля с инъекцией физиологического раствора).
Рисунок 6.Метазоламид улучшает потерю веса мозга и предотвращает гипертрофию желудочков у мышей R6 / 2. На 25 неделе были получены группы мышей R6 / 2, обработанных физиологическим раствором и обработанных метазоламидом, и контрольных мышей дикого типа из однопометников. A . Потеря массы мозга у мышей, получавших метазоламид (40 мг / кг), была значительно улучшена по сравнению с мышами R6 / 2, получавшими физиологический раствор ( n = 5 для контрольных мышей дикого типа; n = 4 для мышей R6 / 2, получавших как физиологический раствор, так и метазоламид).Планки погрешностей представляют стандартное отклонение. B . Как грубая атрофия головного мозга, так и увеличение желудочков (слева), и атрофия нейронов (справа), присутствующие у мышей R6 / 2, получавших физиологический раствор, были значительно уменьшены введением метазоламида. Масштабные линейки, 2 мм (для крупного мозга), 100 мкм (для нейронов полосатого тела). Невропатологические данные сравнивали с помощью ANOVA или повторных измерений ANOVA и непарного теста Стьюдента t (Statview). * р <0,05. Данные являются репрезентативными для n = 5 для контрольных мышей дикого типа, n = 4 для мышей R6 / 2, получавших как физиологический раствор, так и метазоламид.
Рисунок 7.Метазоламид предотвращает высвобождение цитохрома c и задерживает маркеры прогрессирования заболевания у мышей R6 / 2. A , Лизаты ткани мозга 25-недельных мышей разделяли на цитозольные фракции. Образцы белков разделяли с помощью SDS / PAGE, зондировали антителом к цитохрому c и повторно зондировали антителом к β-актину. Каждая дорожка представляет собой лизат мозга отдельной мыши. Проиллюстрированный блот был получен из лизатов трех мышей на группу.Высвобождение цитохрома c оценивали в двух независимых испытаниях в общей сложности на семи мышах дикого типа, шести мышах R6 / 2, получавших физиологический раствор, и шести мышах R6 / 2, получавших метазоламид. Денситометрия была проведена для количественной оценки каждой дорожки, чтобы можно было сравнить сигналы от цитохрома c с сигналом от β-актина ( n = 7 для контрольных мышей дикого типа, n = 6 для обработанных физиологическим раствором и метазоламида. -обработанных мышей R6 / 2). Статистическую значимость оценивали с помощью теста t .* p <0,05, ** p <0,001. B , иммунореактивность DARP-32 в нейронах полосатого тела неостриатума. По сравнению как с контрольными мышами из однопометных однопометников дикого типа, так и с мышами R6 / 2, получавшими метазоламид, наблюдалось заметное снижение количества интенсивно иммуноокрашенных нейронов DARP32 у мышей R6 / 2, обработанных физиологическим раствором. C , Иммунореактивность Хантингтина у мышей R6 / 2, получавших метазоламид. Иммуноокрашенные Хантингтином срезы тканей неостриатума необработанных и обработанных метазоламидом трансгенных мышей R6 / 2.Количество и размер агрегатов хантингтина, а также интенсивность иммуноокрашивания существенно не различаются у мышей, получавших метазоламид. Шкала 100 мкм. Для B и C данные являются репрезентативными из n = 5 для контрольных мышей дикого типа, n = 4 для мышей R6 / 2, обработанных физиологическим раствором и метазоламидом.
Обсуждение
Поскольку высвобождение цитохрома c из митохондрий запускает активацию каспаз, блокирование этого критического шага должно мешать программе гибели клеток, тем самым спасая умирающие нейроны.Высвобождение цитохрома c и активация нижестоящих путей клеточной гибели были четко идентифицированы in vivo в большом количестве острых (например, ишемия, повреждение спинного мозга и черепно-мозговые травмы) и хронических (например, БАС и болезнь Хантингтона). ) нейродегенеративные заболевания. Однако доказательства, четко демонстрирующие функциональную роль высвобождения цитохрома c в моделях неврологических заболеваний, ограничены. Хотя миноциклин ингибирует высвобождение цитохрома c и является нейропротекторным, это могут быть другие функции, которые могут объяснить его защитную функцию.Чтобы обеспечить дополнительную поддержку функциональной роли высвобождения цитохрома c при HD и других нейродегенеративных заболеваниях, необходимо идентифицировать новые ингибиторы высвобождения цитохрома c . С этой целью мы разработали бесклеточный скрининговый анализ для выявления ингибиторов митохондриального высвобождения цитохрома c . Очищенные митохондрии, подвергшиеся воздействию ионов Ca 2+ , обеспечивают необходимую систему in vitro . Высвобожденный цитохром c (т.е., то, что остается в супернатанте после удаления органелл центрифугированием) можно легко обнаружить с помощью ELISA. Те соединения, которые уменьшают результирующий сигнал, являются многообещающими кандидатами в нейропротекторные препараты. Затем соединения из полученного «короткого списка» были проанализированы на их способность спасать культивируемые клетки, подвергнутые стимуляции клеточной гибели, инкубации при недопустимой температуре. Лекарства / соединения, которые защищают эти клеточные системы, дополнительно оцениваются в испытаниях на животных моделях.В конечном итоге, биологически безопасные и потенциально лечебные агенты могут быть протестированы на людях, страдающих хроническими нейродегенеративными заболеваниями, такими как HD. Миноциклин и доксициклин, два соединения, которые априори известны как замедляющие нейродегенерацию (Yrjänheikki et al., 1998; Chen et al., 2000; Brundula et al., 2002; Wu et al., 2002; Zhu et al., 2002; Friedlander, 2003; Wang et al., 2003), особенно эффективны при ингибировании высвобождения цитохрома c из очищенных митохондрий. Эти наблюдения обнадеживают, поскольку они предполагают, что анализ in vitro имеет прогностическую ценность.Однако положительный результат изолированного митохондриального скрининга сам по себе не дает окончательного указания на возможную эффективность или безопасность агента. Госсипол может быть примером «ложноположительного» агента. Госсипол – хорошо известный респираторный яд (разобщитель), учитывая, что сильный митохондриальный респираторный токсин будет иметь положительную оценку как ингибитор любого события, которое требует активного протонного градиента, такого как транспорт кальция, разумно принять во внимание наше наблюдение, что госсипол эффективен в изолированном митохондриальном скрининге (занимает первое место), но токсичен для интактных клеток (клеточный скрининг) (Floridi et al., 1984).
Поскольку разные скрининговые кампании и разные модельные системы могут давать разные «хитовые» соединения, до сих пор не существует единой мощной и проверенной модели для болезни Хантингтона или других нейродегенеративных заболеваний. Используя наш трехуровневый процесс отбора (анализ активности в бесклеточной системе, наблюдение за воздействием на культивируемые клетки и, наконец, испытания на животных моделях), мы последовательно сужали список потенциально терапевтических соединений. Из 21 соединения, выбранного в первоначальном скрининге, 16 оказались защищающими клетки в культуре.Таким образом, наше исследование обеспечивает доказательство принципа того, что скрининг ингибиторов высвобождения цитохрома c из очищенных митохондрий является полезным методом для выявления лекарств, потенциально способных замедлить нейродегенерацию.
Кроме того, наши наблюдения представляют собой первое сообщение о способности метазоламида приносить пользу мышам R6 / 2. СА представляет собой цинксодержащий фермент, катализирующий обратимую гидратацию диоксида углерода: CO 2 + H 2 O <-> HCO3 (-) + H +.Существует семь изоферментов CA млекопитающих, CA I-VII. До сих пор механизм действия метазоламида заключается в ингибировании целевых изоферментов CA с уменьшением уровня бикарбоната и сильным влиянием на pH. Кроме того, сообщалось, что метазоламид является эффективным ингибитором CA II (hCA II) человека и митохондриального hCA V. Учитывая, что метазоламид ингибирует высвобождение цитохрома c / Smac / фактора, индуцирующего апоптоз, и замедляет диссипацию градиента митохондриального потенциала в этом Мы предполагаем, что митохондриальный hCA V может участвовать в нейропротекции метазоламидом в живых клетках мутантного HTT14A и у трансгенных мышей R6 / 2.Однако метазоламид может действовать независимо от изоферментов CA, он может действовать на другие мишени в клеточной и / или животной модели HD, такие как NADH-оксидаза, или ингибировать гибель нейрональных клеток с участием активных форм кислорода. В свете того факта, что метазоламид, который в настоящее время используется в клинической практике в качестве хронического средства для лечения пациентов с глаукомой, хотя и является слабым диуретиком, не должен иметь чрезмерных побочных эффектов при использовании в испытаниях на людях. Мы надеемся, что метазоламид также будет иметь клиническую ценность для лечения людей, страдающих нейродегенеративными заболеваниями.
В совокупности эти эксперименты продемонстрировали, что метазоламид обладает защитным действием на животной модели хронической нейродегенерации. Сделанные выше выводы относятся именно к этому препарату. Однако это исследование имеет более широкое значение. Он демонстрирует, что анализ in vitro на высвобождение цитохрома c из митохондрий, стимулированных Ca 2+ , может быть использован для скрининга потенциально терапевтических соединений и предоставляет дополнительные in vivo доказательства важности высвобождения цитохрома c в процессе нейродегенерации.На физиологическом уровне это подтверждает, что нацеливание на этот молекулярный процесс является рациональным подходом к разработке методов лечения хронических неврологических заболеваний, таких как HD.
Нарушение передачи сигналов Ca2 + и апоптоз нейронов со средними шипами при болезни Хантингтона
Абстрактные
Болезнь Хантингтона (HD) вызывается экспансией полиглутамина (exp) в гентингтине. Здесь мы использовали модель HD у трансгенных мышей с искусственной хромосомой дрожжей (YAC), чтобы исследовать связь между нарушенной передачей сигналов кальция (Ca 2+ ) и апоптозом средних шиповидных нейронов HD (MSN).Повторное нанесение глутамата повышает уровни цитозольного Ca 2+ в MSN у мышей YAC128, но не в MSN у мышей YAC18 дикого типа или контрольной мыши. Применение глутамата приводит к апоптозу MSN YAC128, но не MSN дикого типа или YAC18 MSN. Анализ индуцированного глутаматом апоптоза YAC128 MSN показал, что (–) действия глутамата опосредуются глутаматными рецепторами mGluR1 / 5 и NR2B; ( II ) блокаторы мембранопроницаемых инозитол-1,4,5-трифосфатных рецепторов 2-APB и эноксапарин (Lovenox) обладают нейрозащитным действием; ( iii ) апоптоз включает внутренний путь, опосредованный высвобождением митохондриального цитохрома c и активацией каспаз 9 и 3; ( iv ) апоптоз требует перегрузки митохондрий Ca 2+ и может быть предотвращен митохондриальным блокатором унипортера Ca 2+ рутением 360; и ( v ) апоптоз включает открытие митохондриальной переходной поры проницаемости (MPTP) и может быть предотвращен блокаторами MPTP, такими как бонгкрековая кислота, нортриптилин, дезипрамин, трифлуоперазин и мапротилин.Эти находки описывают путь, непосредственно связывающий нарушенную передачу сигналов Ca 2+ и дегенерацию MSN в хвостатом ядре при HD. Эти данные также предполагают, что блокаторы Ca 2+ и МРТР могут иметь терапевтический потенциал для лечения HD.
Болезнь Хантингтона (БХ) обычно начинается в возрасте от 35 до 50 лет с хореи и психических расстройств и постепенного, но неумолимого снижения умственного развития до смерти через 15-20 лет (1). Невропатологический анализ показывает избирательную и прогрессирующую потерю нейронов в полосатом теле (1), особенно влияющую на ГАМКергические нейроны со средним шипом (MSN).На молекулярном уровне причиной HD является экспансия полиглутамина (exp) на аминоконце хантингтина (Htt), повсеместно экспрессируемого цитоплазматического белка массой 350 кДа (2). Несмотря на значительный прогресс, клеточные механизмы, связывающие мутацию Htt exp с заболеванием, плохо изучены (3).
Был создан ряд моделей трансгенных мышей HD, которые воспроизводят многие HD-подобные функции (4). В модели мыши с искусственной хромосомой дрожжей (YAC128) полноразмерный белок Htt человека с полиглутамином exp (128Q) экспрессируется под контролем его эндогенного промотора и регуляторных элементов (5).Начало моторного дефицита перед потерей нейронов полосатого тела в модели мышей YAC128 точно повторяет прогрессирование HD (5). Таким образом, модель мыши YAC128 идеально подходит для понимания клеточных механизмов, которые приводят к нейродегенерации при HD, а также для проверки потенциальных терапевтических агентов.
Предыдущие исследования продемонстрировали, что Htt exp способствует активности подтипа NR2B рецепторов NMDA (NMDAR) (6-8) и рецепторов инозитола 1,4,5-трифосфата типа 1 (InsP 3 R1) (9) .Связь между нарушенной передачей сигналов Ca 2+ и апоптозом нейронов хорошо установлена (10, 11), и поэтому мы предположили, что индуцированная Htt exp перегрузка Ca 2+ приводит к дегенерации MSN при HD (12). Чтобы проверить эту гипотезу, мы проанализировали сигналы Ca 2+ и апоптотическую гибель клеток в первичных культурах MSN мышей YAC128. Наши результаты дополнительно подтверждают гипотезу о том, что нарушенный Ca 2+ лежит в основе гибели нейрональных клеток при HD (12), и позволили нам идентифицировать ряд потенциальных терапевтических мишеней для лечения HD.
Материалы и методы
Первичные нейрональные культуры. Получение и разведение трансгенных мышей YAC18 и YAC128 (фоновый штамм FVBN / NJ) описаны в ссылках. 5 и 13. Гетерозиготных мышей-самцов YAC128 или YAC18 скрещивали с самками мышей дикого типа (WT), и полученные пометы собирали в постнатальные дни 1-2. Щенки были генотипированы с помощью ПЦР с праймерами, специфичными для экзонов 44 и 45 гена Htt человека, и культуры средних колючих нейронов (MSN) или нейронов гиппокампа (HN) мышей WT, YAC18 и YAC128 были созданы и поддерживались, как описано в ссылке.9.
Ca 2+ Эксперименты по визуализации. Fura-2 Ca 2+ эксперименты по визуализации с культурами MSN от 14 до 16 DIV (дни in vitro ), как описано в ссылке. 9, с использованием осветителя DeltaRAM, камеры IC-300 и программного обеспечения imagemaster pro (все из PTI, Южный Брансуик, Нью-Джерси). Клетки поддерживали в искусственной спинномозговой жидкости (aCSF) (140 мМ NaCl / 5 мМ KCl / 1 мМ MgCl 2 /2 мМ CaCl 2 /10 мМ Hepes, pH 7.3) при 37 ° C во время измерений (нагреватель Ph2, Warner Instruments, Хамден, Коннектикут). Изображения Fura-2 с соотношением 340/380 собирались каждые 6 секунд в течение эксперимента. Базовые (1–3 мин) измерения были получены перед первым импульсом глутамата. Раствор глутамата 20 мкМ растворяли в aCSF и наносили 1-минутные импульсы раствора глутамата 37 ° C (проточный нагреватель раствора SH-27B, Warner Instruments), используя контроллер клапана (VC-6, Warner Instruments), управляемый генератор прямоугольных импульсов (модель 148A, Wavetek, Сан-Диего).Ответы Ca 2+ , индуцированные DHPG (3,5-дигидроксифенилглицином), были измерены в aCSF без Ca 2+ (без CaCl 2 из aCSF и с добавлением 100 мкМ EGTA). Для экспериментов с эноксапарином MSN предварительно инкубировали в среде, содержащей 200 мкг / мл эноксапарина, в течение 3 часов. Эноксапарин был включен в концентрации 200 мкг / мл во все растворы на этапах визуализации Fura-2 и Ca 2+ .
Эксперименты по окрашиванию TUNEL. 14-DIV MSN или HN подвергали в течение 8 часов воздействию ряда концентраций глутамата, добавленного в культуральную среду.Во время воздействия глутамата клетки поддерживали в инкубаторе для клеточных культур (увлажненный 5% CO 2 , 37 ° C). (+) MK-801, ифенпродил, MPEP [2-метил-6- (фенилэтинил) пиридин гидрохлорид], CPCCOEt {7- (гидроксиимино) циклопропа [ b ] этиловый эфир хромен-1a-карбоксилата} и рутений (Ru ) 360 добавляли в среду для культивирования клеток за 30 мин до добавления глутамата. 2-APB, эноксапарин, Z-VAD-FMK, Z-FA-FMK, Z-DEVD-FMK, Z-LEHD-FMK, Z-IETD-FMK, бонгкрековая кислота, нортриптилин, пирензепин, прометазин, дезипрамин, трифтороперазин, тиотиксен , и мапротилин добавляли за 2–3 ч до воздействия глутамата.Сразу после воздействия глутамата нейроны фиксировали в течение 30 минут в 4% параформальдегиде плюс 4% сахарозе в PBS (pH 7,4), пермеабилизировали в течение 5 минут в 0,25% Triton X-100 и окрашивали с помощью системы DeadEnd Fluorometric TUNEL System (Promega ) в соответствии с инструкциями производителя. Ядра контрастировали 5 мкМ пропидия иодидом (PI) (Molecular Probes). Покровные стекла тщательно промывали PBS и помещали в Mowiol 4-88 (Polysciences). FITC- и PI-флуоресцентные изображения получали с помощью микроскопа Olympus IX70 с объективами × 40, используя камеру Cascade: 650 (Roper Scientific) и программное обеспечение metafluor (Universal Imaging, Downingtown, PA).Было зафиксировано от четырех до шести случайно выбранных микроскопических полей, содержащих 200–300 MSN, и количество TUNEL-положительных нейрональных ядер рассчитывалось как доля PI-положительных нейрональных ядер в каждом микроскопическом поле наблюдателем, не имеющим отношения к природе образца. Ядра глиальных клеток, идентифицированные по большому размеру и слабому окрашиванию PI, в анализе не учитывались. Доли TUNEL-положительных ядер, определенные для каждого микроскопического поля, были усреднены, и результаты представлены в виде средних значений ± стандартное отклонение ( n = количество подсчитанных полей).
Эксперименты с плоским липидным бислоем. Одноканальные записи InsP мозжечка крысы 3 R1 выполняли, как описано в ссылке. 14. Вкратце, микросомы мозжечка крысы выделяли дифференциальным центрифугированием и сливали с плоскими липидными бислоями. Активность InsP 3 -закрытых каналов регистрировали при трансмембранном потенциале 0 мВ с использованием 50 мМ Ba 2+ (транс), растворенного в Hepes (pH 7,35), в качестве носителя заряда.Цис (цитозольная) камера содержала 110 мМ Трис, растворенный в Hepes (pH 7,35), 0,5 мМ Na 2 АТФ и pCa 6,7 (0,2 мМ EGTA плюс 0,14 мМ CaCl 2 ). Cerebellar InsP 3 R1 активировали добавлением 2 мкМ InsP 3 (Alexis) в цис-камеру. В цис-камеру добавляли различные концентрации эноксапарина. Стробируемые токи InsP 3 были усилены (OC-725, Warner Instruments), отфильтрованы с частотой 1 кГц 8-полюсным фильтром Бесселя нижних частот, оцифрованы на частоте 5 кГц (Digidata 1200, Axon Instruments) и сохранены на компьютере. жесткий диск и оптические диски.Для автономного компьютерного анализа (pclamp 6, Axon Instruments) токи фильтровали в цифровом виде с частотой 500 Гц. Для представления текущих трасс данные были отфильтрованы с частотой 200 Гц.
Анализ высвобождения цитохрома c. Культуры MSN при 12-14-DIV подвергали воздействию глутамата в течение 5 часов, один раз промывали PBS, соскребали в буфере для гомогенизации (0,32 М сахароза / 25 мМ Hepes, pH 8,0 / 1 мМ EDTA / 1 мМ DTT / протеаза. ингибиторы), гомогенизировали и осветляли 60-минутным вращением при 100000 × г .Супернатант собирали как растворимую фракцию, и концентрацию белка в каждом образце определяли с использованием набора для анализа белка BioRad. И осадок, и супернатант лизировали в буфере для загрузки SDS и кипятили. Образцы разделяли с помощью SDS / PAGE, анализировали вестерн-блоттингом с моноклональным антителом против цитохрома c (BD Pharmingen) и количественно оценивали с помощью денситометрии.
Наркотики. Ru360 и 2-APB были от Calbiochem. Глутамат, MPEP, CPCCOEt, (+) – малеат MK801 и ифенпродил были приобретены у Tocris.Z-VAD-FMK, Z-FA-FMK, Z-DEVD-FMK, Z-LEHD-FMK и Z-IETD-FMK были от R&D Systems. Бонгкрековая кислота, нортриптилин, пирензепин, прометазин, дезипрамин, трифлуоперазин, тиотиксен и мапротилин были от Sigma-Aldrich.
Результаты
Нарушенный Ca 2+ Сигналы в YAC128 MSN. Предыдущие результаты (6–9) показали, что глутамат должен вызывать наднормальные ответы Ca 2+ при HD MSN. Чтобы проверить эту гипотезу, мы сравнили индуцированные глутаматом сигналы Ca 2+ в первичных культурах MSN, полученных от мышей WT, YAC18 (13) и YAC128 (5).Чтобы имитировать физиологические условия более точно, мы применяли повторяющиеся импульсы 20 мкМ глутамата длительностью 1 мин с последующей промывкой в течение 1 мин (рис. 1). Внутриклеточная концентрация Ca 2+ в этих экспериментах постоянно отслеживалась с помощью визуализации Fura-2, и данные были представлены в виде соотношений 340/380 (рис. 1). В среднем, базальные уровни Ca 2+ до применения глутамата существенно не отличались друг от друга для всех трех групп MSN (Рис.1 D ).Таким образом, увеличение базальных уровней MSN Ca 2+ у крыс и мышей в результате сверхэкспрессии Htt, наблюдаемой в наших предыдущих экспериментах (9, 15), скорее всего, является результатом высоких уровней экспрессии Htt в трансфицированном MSN. Повторяющиеся импульсы глутамата вызывали значительное повышение уровней Ca 2+ в YAC128 MSN (Рис. 1 C ), по сравнению с гораздо меньшими возрастаниями Ca 2+ в WT (рис.1 A ) и YAC18 (рис.1 B ) MSN.В среднем уровни Ca 2+ после 20 импульсов глутамата существенно не различались между WT и YAC18 MSN, но были значительно ( P <0,05) выше в YAC128 MSN по сравнению с WT или YAC18 MSN (рис.1 ). D ).
Рисунок 1.Нарушенная передача сигналов Ca 2+ в YAC128 MSN.( A – C ) Повторяющееся нанесение 20 мкМ глутамата индуцирует сигналы Ca 2+ в MSN от мышей WT ( A ), YAC18 ( B ) и YAC128 ( C ). Уровни цитозольного Ca 2+ представлены как соотношение 340/380 Fura-2. Каждый импульс глутамата показан в виде черной полосы (1 мин), а этап вымывания показан белой полосой (1 мин) над кривой Ca 2+ . Показанные кривые представляют собой средние кривые для всех MSN для каждой экспериментальной группы. ( D ) Средние значения 340/380 (среднее ± стандартное отклонение) до и после 20 импульсов глутамата показаны для WT ( n = 50), YAC18 ( n = 18) и YAC128 ( n ). = 40) MSN, как указано.После 20 импульсов глутамата уровни Ca 2+ в YAC128 MSN значительно ( *** , P <0,05) выше, чем в WT или YAC18 MSN.
In Vitro HD Модель. Затем мы создали модель « in vitro HD», которая воспроизводит Htt exp -зависимую дегенерацию MSN. Эти эксперименты были выполнены с первичными культурами WT, YAC18 и YAC128 MSN.На 14 DIV все три группы MSN были заражены 8-часовым применением глутамата (от 0 до 250 мкМ) для имитации физиологической стимуляции. После воздействия глутамата MSN фиксировали, повышали проницаемость и оценивали апоптотическую гибель клеток с использованием окрашивания TUNEL. Мы определили, что в исходных условиях (без добавления глутамата) ≈10% MSN во всех трех экспериментальных группах были апоптотическими (TUNEL-положительными) (рис.2 A и B ). ). Добавление 25 или 50 мкМ глутамата увеличивало количество апоптотических клеток до 15–20% во всех трех экспериментальных группах (рис.2 A и B ). Добавление 100 или 250 мкМ глутамата увеличивало апоптотическую гибель до 60–70% для YAC128 MSN (рис. 2 A и B ). ), но только до 25–30% для WT и YAC18 MSN (рис. 2 A и B ). Таким образом, мы пришли к выводу, что воздействие глутамата в диапазоне концентраций 100–250 мкМ приводит к селективному апоптозу YAC128 MSN. В качестве дополнительного контроля для специфичности наблюдаемой дегенерации мы сравнили индуцированный глутаматом апоптоз в первичных культурах нейронов гиппокампа (HN) WT и YAC128, которые сохранились при HD (1).Никаких существенных различий в апоптозе HN мышей WT и YAC128 в диапазоне концентраций глутамата 0-500 мкМ (8-часовая экспозиция) не было обнаружено (данные не показаны).
Рис. 2.Тест in vitro HD. ( A ) MSN с четырнадцатью DIV от мышей WT, YAC18 и YAC128 подвергали воздействию ряда концентраций глутамата в течение 8 часов, фиксировали, повышали проницаемость и анализировали с помощью окрашивания TUNEL (зеленый) и контрастного окрашивания PI.( B ) Долю TUNEL-положительных ядер MSN определяли, как показано в A , и наносили на график в зависимости от концентрации глутамата для мышей WT (белые кружки), YAC128 (темные кружки) и YAC18 (заштрихованные треугольники). Для каждой концентрации глутамата данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение ( n = 4–6 микроскопических полей, 200–300 MSN на поле). При 100 и 250 мкМ глутамата фракция TUNEL-положительного MSN значительно ( P <0,05) выше для YAC128, чем для WT или YAC18.Аналогичные результаты были получены с 10 независимыми препаратами MSN.
Нарушенный Ca 2+ Передача сигналов и вырождение MSN в HD. Чтобы проверить связь между нарушенной передачей сигналов Ca 2+ (рис. 1) и глутамат-индуцированной дегенерацией YAC128 MSN (рис. 2), мы оценили ранее описанный анализ « in vitro HD» в присутствии Ca 2+ блокираторы сигнализации. Мы обнаружили, что ингибирование рецепторов mGluR1 / 5 (смесью MPEP и CPCCOEt) снижает индуцированный глутаматом апоптоз YAC128 MSN до уровней MSN WT (рис.3 А ). Ингибирование NMDAR с помощью (+) MK801 имело аналогичный нейрозащитный эффект (данные не показаны). NR2B-специфический антагонист ифенпродил также уменьшал индуцированный глутаматом апоптоз YAC128 MSN до уровней MSN дикого типа (фиг. 3 B ). Комбинация блокаторов mGluR1 / 5 и NMDAR [MPEP, CPCCOEt и (+) MK801] полностью устраняет глутамат-зависимую апоптотическую гибель клеток как в WT, так и в YAC128 MSN (рис. 3 C ). ). В предыдущем исследовании мы продемонстрировали, что InsP 3 R1-опосредованное высвобождение Ca 2+ усиливается в MSN, трансфицированном плазмидами экспрессии Htt exp (9).В соответствии с прямым участием InsP 3 R1, предварительная инкубация культур MSN с проницаемым для мембран InsP 3 R блокатором 2-APB (16) защищала YAC128 MSN от апоптоза, индуцированного глутаматом (рис. 3 D ). ).
Рис 3.Ca 2+ блокаторы предотвращают апоптоз YAC128 MSN.Четырнадцать-DIV MSN подвергали воздействию различных концентраций глутамата в течение 8 часов, фиксировали, повышали проницаемость и анализировали окрашиванием TUNEL, как описано в легенде на фиг. 2. Доля TUNEL-положительных ядер MSN нанесена на график в зависимости от концентрации глутамата для WT. (белые кружки) и YAC128 (YAC, темные кружки) мыши. Для каждой концентрации глутамата данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение ( n = 4–6 микроскопических полей, 200–300 MSN на поле). Сравниваются результаты при отсутствии (черные символы) и наличии (красные символы) блокаторов Ca 2+ .( A ) За 30 минут до нанесения глутамата добавляли двадцать микромолярных MPEP и 50 мкМ CPCCOEt (блокаторы mGluR1 / 5). ( B ) Двадцать микромолярных ифенпродил (блокатор NR2B) добавляли за 30 минут до нанесения глутамата. Аналогичные результаты были получены с 10 мкМ (+) – MK801 (блокатор NMDAR). ( C ) За 30 минут до нанесения глутамата добавляли двадцать микромолярных MPEP, 50 мкМ CPCCOEt и 10 мкМ (+) MK801. ( D ) Четыреста микромолярных 2-APB (мембранопроницаемый блокатор InsP 3 R) добавляли за 3 часа до нанесения глутамата.Для A – D в контрольных условиях гибель клеток YAC128 MSN значительно ( P <0,05) выше, чем гибель клеток MSN дикого типа при 100 и 250 мкМ глутамата. Для A – D в присутствии препаратов YAC128 гибель клеток MSN и гибель клеток WT MSN существенно не отличаются друг от друга. Результаты, представленные в A – D , были повторены с двумя-тремя независимыми препаратами MSN.
Поскольку InsP 3 R1, по-видимому, участвует в индуцированном глутаматом апоптозе YAC128 MSN (рис.3 D ), мы предположили, что InsP 3 R1 может быть потенциальной лекарственной мишенью для лечения HD. Применение в ванне низкомолекулярного гепаринсульфата эноксапарина (Lovenox) предотвращает индуцированное глутаматом высвобождение Ca 2+ в срезах мозжечка, предположительно за счет блокирования активности InsP 3 R1 (17). Чтобы напрямую проверить способность эноксапарина блокировать InsP 3 R1, мы провели серию экспериментов по восстановлению планарного липидного бислоя с микросомами мозжечка крыс.Добавление эноксапарина эффективно и обратимо ингибировало InsP 3 R1 в плоских липидных бислоях (рис. 4 A ), аналогичное действию высокомолекулярного гепарина. Количественный анализ ингибирующего действия эноксапарина на InsP 3 R1 дал IC 50 50 нг / мл и коэффициент Хилла 3,4 (фиг.4 B ), что согласуется со связыванием эноксапарина с каждой субъединицей тетрамера InsP 3 R1. Чтобы установить, что эноксапарин способен блокировать InsP 3 R1 в полосатом теле MSN, мы провели серию экспериментов по визуализации Ca 2+ с Fura-2.Как описано в исх. 9, нанесение 25 мкМ DHPG индуцировало высвобождение Ca 2+ в культивируемом MSN в среде без Ca 2+ (фиг. 4 C ). Предварительная инкубация с 200 мкг / мл эноксапарина в течение 3 ч предотвращала вызванное DHPG высвобождение Ca 2+ в культивируемых MSN (рис. 4 D ). ), что согласуется со способностью эноксапарина проникать через клеточные мембраны (17) и блокировать активность InsP 3 R1 (Фиг.4 A и B ).Используя анализ « in vitro HD», мы обнаружили, что 200 мкг / мл эноксапарина защищали YAC128 MSN от апоптоза, индуцированного глутаматом (рис. 4 E ), что согласуется с данными 2-APB (рис.3 D ).
Рис. 4.Эноксапарин защищает YAC128 MSN от апоптоза. ( A ) Эноксапарин обратимо ингибирует активность InsP 3 R1 мозжечка в плоских липидных бислоях.Каждая кривая тока соответствует 2 секундам записи тока из того же эксперимента. InsP 3 -закрытые каналы в бислое активировали 2 мкМ InsP 3 (вторая кривая). Эноксапарин добавляли к плоским липидным бислоям в конечных концентрациях, показанных рядом с третьей, четвертой и пятой кривыми. Растворы эноксапарина и InsP 3 были удалены перфузией (вымывание, шестой след). Каналы, закрываемые InsP 3 в бислоях, реактивировали добавлением 2 мкМ InsP 3 (седьмая кривая).Аналогичные результаты были получены в 10 независимых экспериментах. ( B ) Вероятность открытия InsP 3 R1 ( P или ) в присутствии 2 мкМ InsP 3 и различных концентраций эноксапарина. Для каждого эксперимента полученные результаты нормировались на P o в том же эксперименте в отсутствие эноксапарина. Нормализованные данные четырех независимых экспериментов были усреднены вместе и показаны как средние значения ± стандартное отклонение (закрашенные кружки).Нормализованные и усредненные данные соответствовали уравнению P = 1 / (1 + ([Enox] / IC 50 ) № ). Наилучшее соответствие данным (гладкая кривая) дало IC 50 50 нг / мл и коэффициент Хилла 3,4. ( C и D ) Ca 2+ ответы, индуцированные 25 мкМ DHPG в среде без Ca 2+ в контрольной MSN ( C , n = 19) и в MSN, предварительно инкубированных с 200 мкг / мл эноксапарина в течение 3 часов ( D , n = 50).Показаны средние трассировки для всех MSN в группе. ( E ) Эноксапарин в концентрации 200 мкг / мл добавляли к WT и YAC128 (YAC) 14-DIV MSN за 3 часа до нанесения глутамата. Результаты окрашивания TUNEL были количественно оценены и представлены, как описано в легенде на фиг. 3. Гибель клеток YAC128 MSN значительно ( P <0,05) снижается при добавлении эноксапарина при концентрациях глутамата 100 и 250 мкМ. Аналогичные результаты были получены с двумя независимыми препаратами MSN.
Внутренний апоптотический путь, митохондрии и дегенерация HD MSN. Какой путь апоптоза участвует в индуцированной глутаматом дегенерации HD MSN? Предварительная инкубация с ингибитором проницаемой через мембрану панкаспазы (Z-VAD-FMK), но не с контрольным пептидом (Z-FA-FMK), снижала индуцированный глутаматом апоптоз YAC128 MSN до уровней WT (рис. 5 A ). ). Таким образом, апоптоз YAC128 MSN происходит по каспазозависимому пути. Мембраннопроницаемые ингибиторы каспазы-3 (Z-DEVD-FMK) и каспазы-9 (Z-LEHD-FMK) также защищали YAC128 MSN от глутамат-индуцированного апоптоза (рис.5 B и C ). Напротив, мембранопроницаемый ингибитор каспазы-8 (Z-IETD-FMK) оказался неэффективным (рис. 5 D ). ). Эти результаты согласуются с индуцированным глутаматом апоптозом YAC128 MSN, происходящим по внутреннему (опосредованному митохондриями и каспазой-9), а не через внешний (опосредованный рецептором смерти и каспазой-8) путь.
Инжир.5.Апоптоз YAC128 MSN опосредуется внутренним путем. ( A – D ) Ингибиторы проницаемых для мембраны каспаз добавляли к 14-DIV WT и YAC128 (YAC) MSN за 3 часа до нанесения глутамата. Результаты окрашивания TUNEL были количественно определены и представлены, как описано в легенде на фиг. 3. Сравниваются результаты в присутствии ингибиторов каспаз (красные символы) и контрольного пептида Z-FA-FMK, добавленных в той же концентрации (черные символы). . ( A ) Двадцать микромолярный ингибитор панкаспазы Z-VAD-FMK.( B ) Пятьдесят микромолярный ингибитор каспазы-3 Z-DEVD-FMK. ( C ) Пятьдесят микромолярный ингибитор каспазы-9 Z-LEHD-FMK. ( D ) Пятьдесят микромолярный ингибитор каспазы-8 Z-IETD-FMK. Гибель клеток YAC128 MSN значительно ( P <0,05) снижается при добавлении блокаторов панкаспазы ( A ), каспазы-3 ( B ) и каспазы-9 ( C ) при 100 и Концентрация глутамата 250 мкМ. Ингибирование каспазы-8 ( D ) не имело статистически значимого эффекта на гибель клеток YAC128 MSN при концентрациях глутамата 100 или 250 мкМ.Результаты, представленные в A – D , были повторены с двумя-тремя независимыми препаратами MSN. ( E ) Высвобождение цитохрома c количественно определяют вестерн-блоттингом митохондриальных (осадок) и цитозольных (растворимых) фракций, полученных из WT и YAC128 MSN, после 5-часового воздействия глутамата. ( F ) Десять микромолярных Ru360 добавляли за 30 мин до нанесения глутамата на WT и YAC128 (YAC) MSN. Результаты окрашивания TUNEL были количественно оценены и представлены, как описано в легенде на рис.3. Гибель клеток YAC128 MSN значительно ( P <0,05) снижается при добавлении Ru360 при концентрациях глутамата 100 и 250 мкМ.
Активация внутреннего апоптотического пути требует высвобождения цитохрома c из внутримитохондриального пространства в цитоплазму (10, 11). Когда WT MSN инкубировали со 100 или 250 мкМ глутамата в течение 5 часов, наблюдалось небольшое повышение уровней цитозольного цитохрома c (рис.5 E ). Напротив, 5-часовая инкубация YAC128 MSN с 250 мкМ глутамата привела к гораздо большему увеличению сигнала цитозольного цитохрома c (рис. 5 E ). Эти данные согласуются с активацией внутреннего апоптотического пути в YAC128 MSN, но не в WT MSN, в результате воздействия 250 мкМ глутамата в наших экспериментах (рис.2 A и B ). ).
Нарушена ли цитозольная передача сигналов Ca 2+ в YAC128 MSN (рис.1 C и D ) связан с высвобождением цитохрома c из внутреннего митохондриального пространства (рис. 5 E ) неизвестно. Хорошо известно, что избыточный цитозольный Ca 2+ эффективно поглощается митохондриями за счет активности митохондриального унипортера / канала Ca 2+ (MCU), расположенного во внутренней мембране митохондрий (18). В соответствии с участием MCU в наших экспериментах, предварительная инкубация MSN с мембранопроницаемым блокатором MCU Ru360 (18, 19) снижала индуцированную глутаматом апоптотическую гибель клеток YAC128 MSN до уровней MSN WT (рис.5 F ).
Было высказано предположение, что перегрузка митохондрий Ca 2+ приводит к высвобождению цитохрома c из-за открытия митохондриальной переходной поры проницаемости (MPTP) (10, 11). В соответствии с ролью MPTP, мы продемонстрировали, что предварительная инкубация с 10 мкМ ингибитором MPTP бонгкрековой кислотой (BKA) (20) снижает индуцированный глутаматом апоптоз YAC128 MSN до уровней WT (Таблица 1). Недавно ряд биологически активных гетероциклических, трициклических и производных фенотиазина, одобренных Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов, были идентифицированы как предполагаемые блокаторы МФТП (21).Чтобы определить потенциальную полезность этих соединений для лечения HD, мы провели аналитические эксперименты « in vitro, HD» с соединениями этого класса. Мы обнаружили, что предварительная инкубация с 2 мкМ нортриптилина, дезипрамина, трифлуоперазина или мапротилина защищала YAC128 MSN от глутамат-индуцированного апоптоза (таблица 1), что согласуется с их предполагаемой блокирующей активностью МРТР (21). В качестве контроля специфичности наблюдаемых эффектов мы продемонстрировали, что пирензепин и тиотиксен не обладают защитными свойствами (таблица 1), несмотря на сходство в химической структуре.
Таблица 1. Влияние предполагаемых блокаторов МРТР на глутамат-индуцированный апоптоз у WT и YAC128 MSNОбсуждение
Путь, ведущий к апоптозу HD MSN. Как полиглутамин exp в Htt exp приводит к гибели нейронов MSN в полосатом теле, является центральным вопросом в понимании патогенеза HD (3).Наши результаты согласуются с моделью, которая связывает индуцированное Htt exp нарушение передачи сигналов Ca 2+ нейронов с апоптозом MSN при HD (Рис. 6). В частности, мы предполагаем, что глутамат, высвобождаемый кортикостриатными проекционными нейронами, стимулирует рецепторы NR1 / NR2B NMDAR и mGluR5, оба из которых обильно экспрессируются в полосатом теле MSN (22, 23). Активация NR1 / NR2B NMDAR приводит к притоку Ca 2+ и активации рецепторов mGluR5, что приводит к продукции InsP 3 и высвобождению Ca 2+ через InsP 3 R1 (рис.6). Htt exp влияет на передачу сигналов Ca 2+ в HD MSN, повышая чувствительность InsP 3 R1 к активации InsP 3 (9), стимулируя активность NR1 / NR2B NMDAR (6-8) и напрямую дестабилизируя митохондриальный Ca 2+ обработки (24, 25). В результате стимуляция глутаматных рецепторов приводит к сверхнормальным ответам Ca 2+ в HD MSN, что приводит к цитозольной перегрузке Ca 2+ (рис. 6). Избыточный цитозольный Ca 2+ попадает в митохондрии благодаря активности MCU (рис.6). Со временем емкость митохондрий Ca 2+ превышается, что приводит к открытию MPTP, высвобождению цитохрома c в цитозоль и активации внутренней программы апоптоза, опосредованной каспазой (рис. 6). Эти наблюдения предполагают, что отсроченное начало дегенерации MSN при HD, по крайней мере, частично является результатом значительной емкости накопления Ca 2+ в митохондриях, для превышения которой требуется много времени, как мы ранее предполагали (12). С вовлечением митохондрий согласуется наблюдение дисфункциональных митохондрий на моделях мышей HD и у пациентов с HD (24, 25).Аномальные цитозольные и митохондриальные уровни Ca 2+ могут вносить вклад в неврологические аномалии, наблюдаемые у пациентов с HD ранней стадии и в моделях мышей HD до начала нейродегенерации.
Рис. 6.Предложенные механизмы, связывающие нарушенную передачу сигналов Ca 2+ и апоптоз HD MSN. Глутамат, высвобождаемый из нейронов кортикостриатальной проекции, стимулирует рецепторы NR1A / NR2B NMDAR и mGluR5, обильно экспрессируемые в MSN полосатого тела (22, 23).Htt exp влияет на передачу сигналов Ca 2+ в HD MSN, сенсибилизируя InsP 3 R1 к активации InsP 3 (9), стимулируя активность NR2B / NR1 NMDAR (6-8) и дестабилизируя митохондриальный Ca 2 + обработка (24, 25). В результате стимуляция рецепторов глутамата приводит к сверхнормальным ответам Ca 2+ в HD MSN и митохондриальной перегрузке Ca 2+ . Как только митохондриальная емкость хранения Ca 2+ превышается, МРТР открывается, что приводит к высвобождению цитохрома c в цитозоль и активации каспаз 9 и 3.Активация каспазы-3 приводит к прогрессированию апоптоза, дегенерации MSN и HD. Модель подтверждается способностью блокаторов (показаны красным) снижать индуцированный глутаматом апоптоз YAC128 MSN до уровней WT в наших экспериментах. Блокаторами, которые оказались эффективными в наших экспериментах, являются блокатор NMDAR (+) MK801 и специфический блокатор NR2B ифенпродил; специфичные для mGluR1 / 5 блокаторы MPEP и CPC-COEt; мембранопроницаемый InsP 3 блокаторы R1 2-APB и эноксапарин; Блокиратор микроконтроллеров Ru360; Блокаторы MPTP BKA, нортриптилин, дезипрамин, трифлуоперазин и мапротилин; мембранопроницаемый блокатор каспазы-9 Z-LEHD-FMK; и блокатор каспазы-3 Z-DEVD-FMK.
Возможные терапевтические цели для лечения HD. Предлагаемая модель (рис. 6) может иметь значение для лечения HD. Наши результаты показывают, что NR2B NMDAR (рис. 3 B ) и mGluR5 (рис.3 A ) можно рассматривать как потенциальные лекарственные мишени для лечения HD. Мы также продемонстрировали, что ингибирование InsP 3 R1 2-APB (фиг. 3 D ), ингибирование MCU Ru360 (рис.5 F ), а ингибирование МРТР бонгкрековой кислотой (таблица 1) снижало индуцированный глутаматом апоптоз YAC128 MSN до уровней MSN дикого типа. Таким образом, InsP 3 R1 и MPTP, по-видимому, представляют собой терапевтические мишени для HD. В наших экспериментах было продемонстрировано, что низкомолекулярный гепарин Эноксапарин (Lovenox) оказывает нейропротекторное действие на YAC128 MSN (рис. 4 E ). ), по-видимому, за счет прямого ингибирования функции InsP 3 R1 (рис.4 A – D ). Внутривенные инъекции эноксапарина обладают нейропротективным действием на животных моделях инсульта и нейродегенеративных заболеваний (26–28), и наши результаты показывают, что эноксапарин также может быть оценен как терапевтическое средство для HD. Недавно ряд биологически активных гетероциклических, трициклических и производных фенотиазина, одобренных Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов, были идентифицированы как предполагаемые блокаторы МФТП (21). В наших экспериментах показано, что несколько представителей этого класса соединений (нортриптилин, дезипрамин, трифлуоперазин и мапротилин) защищают YAC128 MSN от апоптоза, индуцированного глутаматом (таблица 1).Будущие исследования с моделями HD на животных или клинические испытания на людях потребуются для проверки полезности предполагаемых блокаторов MPTP в качестве потенциальных терапевтических средств для лечения HD. Потенциальные побочные эффекты этих соединений, такие как кровотечение при применении эноксапарина и антихолинергическое действие нортриптилина и дезипрамина, необходимо учитывать в клинических условиях.
Благодарности
Мы благодарим Тяньхуа Лея за помощь в поддержании колонии и генотипирования мышей YAC, Линду Паттерсон за административную помощь, Итана Сигнера за содействие нашему сотрудничеству по блокаторам MPTP и Сяодун Ван за советы по экспериментам по высвобождению цитохрома c .И. поддерживается Фондом Роберта А. Велча, Американским обществом болезней Хантингтона, Фондом наследственных болезней, Фондом высокого качества и Национальным институтом неврологических расстройств и инсульта (NINDS), грант R01 NS38082. M.R.H. поддерживается Канадскими институтами исследований в области здравоохранения, Фондом наследственных болезней, Американским обществом болезней Хантингтона и Фондом высокого качества, а также возглавляет Канадский научный руководитель в области генетики человека. B.S.K. поддерживается Фондом наследственных болезней и Фондом высокого качества.R.L. поддерживается грантом NINDS NINDS-NS13742.
Сноски
↵ ∥ Кому корреспонденцию следует направлять по адресу: Департамент физиологии, K4.112, Юго-западный медицинский центр Техасского университета, Даллас, Техас 75390-9040. E-mail: ilya.безпрозванный {at} utsouthwestern.edu.
Вклад авторов: R.L., B.S.K., М.Р.Х. и И.Б. спланированное исследование; T.-S.T., E.S., V.L., I.G.S. и M.S. проведенное исследование; T.-S.T., E.S., V.L., I.G.S., M.S., R.L., M.R.H. и I.B. проанализированные данные; и Б.С.К., М.Р.Х. и И.Б. написал газету.
Сокращения: CPCCOEt, этиловый эфир 7- (гидроксиимино) циклопропа [ b ] хромен-1a-карбоксилата; DIV, дни in vitro ; exp, расширение; HD, болезнь Хантингтона; Htt, Huntingtin; InsP 3 , инозитол-1,4,5-трифосфат; InsP 3 R1, тип 1 InsP 3 рецептор; MCU, митохондриальный Ca 2+ унипортер / канал; MPEP, гидрохлорид 2-метил-6- (фенилэтинил) пиридина; MPTP, митохондриальная проницаемость переходной поры; MSN, нейроны со средними шипами; NMDAR, рецептор NMDA; PI, иодид пропидия; Ру360, Рутений 360.
- Авторские права © 2005, Национальная академия наук
Раки | Бесплатный полнотекстовый | Синергетическая комбинация никлозамида и доксорубицина как эффективная терапия для всех клинических подтипов рака груди
1. Введение
Химиотерапия остается основным терапевтическим методом лечения метастатического рака в клинике. Однако лекарственная устойчивость – одно из основных препятствий на пути к успеху химиотерапии рака [1]. Причины развития резистентности многофакторны и включают изменения биологических и биохимических характеристик раковых клеток [2].Немногочисленные примеры таких изменений включают усиление оттока лекарств с помощью АТФ-зависимых насосов, усиление репарации ДНК, инактивацию апоптотических путей, измененные внутриклеточные мишени для лекарств и мутации мишеней на клеточной поверхности [3]. Примечательно, что различные механизмы, регулирующие устойчивость к лекарствам, регулируются разными сигнальными путями клеток [4]. Следовательно, устойчивость к лекарствам – это процесс, управляемый генами и опосредованный сигнальными путями. Сообщалось, что при раке нарушается регуляция множественных сигнальных путей, таких как PI3K / AKT / mTOR, Notch, Hedgehog, NF-κB, TFG-β, Ras / MAPK, JAK / STAT и Wnt [4].Известно, что наряду с лекарственной устойчивостью эти дисрегулируемые сигнальные пути являются основной причиной инициации, прогрессирования и поддержания онкогенеза [5]. Следовательно, нацеливание на дисрегулируемые сигнальные пути не только поможет преодолеть лекарственную устойчивость раковых клеток, но также сделает их менее онкогенными и химиочувствительными. Ожидается, что при лечении противораковыми препаратами такие химиочувствительные клетки со сниженным онкогенным потенциалом будут подвергаться усиленному апоптозу и обеспечивать лучший терапевтический результат [6,7].Следовательно, комбинаторный подход к нацеливанию на дисрегулируемые сигнальные пути вместе с использованием химиотерапевтических препаратов может быть эффективным подходом для улучшения терапевтического результата для онкологических пациентов. Передача сигналов Wnt / β-катенина является одним из аберрантно экспрессируемых сигнальных путей при множественном раке, который известен. быть связано с развитием резистентности к лечению [8,9]. Более того, аберрантная передача сигналов Wnt инициирует онкогенез за счет поддержания раковых стволовых клеток (CSCs) и вызывает уклонение от иммунитета и переход эпителия в мезенхиму (EMT), все из которых вовлечены в прогрессирование заболевания и неэффективность методов лечения [10].Следовательно, передача сигналов Wnt является потенциальной терапевтической мишенью для преодоления лекарственной устойчивости и улучшения лечения рака [11]. Недавние исследования показывают, что никлозамид (Nic), противоглистный препарат, одобренный FDA, показал многообещающие результаты в качестве ингибитора передачи сигналов Wnt и противоракового агента [12,13]. Nic способен эффективно подавлять передачу сигналов Wnt в нескольких раковых клетках, таких как рак груди, рак простаты, колоректальный рак, рак легких и рак яичников [12,13,14]. Кроме того, поскольку он является одобренным FDA противогельминтным препаратом, его безопасность и фармакокинетический профиль для этого конкретного применения были ранее установлены.Следовательно, перепрофилирование Nic для лечения рака трансляционно менее сложно, что делает его хорошим выбором для нацеливания передачи сигналов Wnt.В настоящем исследовании мы стремились разработать комбинированную терапию на основе никеля и обычного противоракового агента для обеспечения терапевтических преимуществ, связанных с лекарственной устойчивостью и рецидивом заболевания. Мы предположили, что ингибирование аберрантно активированной передачи сигналов Wnt с помощью Nic придает химиочувствительность раковым клеткам, тем самым повышая эффективность обычных противораковых препаратов.В качестве комбинированного партнера для Nic был выбран доксорубицин (Dox), антрациклин, который используется в качестве лекарственного средства первой линии для лечения множественных раковых заболеваний в клинике.
Рак груди – самый распространенный и распространенный вид рака во всем мире. Более того, рак груди является ведущей причиной смертности от рака среди женщин во всем мире. Это подчеркивает необходимость лучшего лечения болезни. С этой мотивацией в настоящем исследовании среди различных типов рака, несущих аберрантно активированную передачу сигналов Wnt, был выбран рак груди для проверки комбинаторной эффективности Nic и Dox.Кроме того, комбинация была протестирована на всех трех клинических подтипах рака груди, а именно. Тройной отрицательный рак молочной железы (TNBC), HER2-положительный рак молочной железы и положительный по рецепторам гормонов (HR) рак молочной железы, поскольку общая таргетная терапия, эффективная при всех подтипах рака молочной железы, пока недоступна. Далее, принимая во внимание гетерогенность рака молочной железы, а также клинические потребности онкологических больных, были изучены два режима комбинированной терапии: последовательная терапия (Nic → Dox) и параллельная терапия (Nic + Dox) [15].Поскольку при последовательной терапии одно лекарство вводится за один раз, оно может показать лучшую комплаентность для пожилых пациентов, у которых снижена способность переносить токсичность нескольких лекарств одновременно, или для пациентов с сопутствующими заболеваниями, или для пациентов с медленно растущими опухолями [ 15,16], тогда как параллельная терапия будет полезна для более молодых пациентов или для пациентов, которым требуется срочное снижение опухолевой нагрузки или которые демонстрируют быстрый рост опухоли [16]. Таким образом, разработанная комбинаторная терапия была оценена в обоих режимах для удовлетворения потребностей разнообразного набора пациентов.Результаты показали, что индивидуальное лечение Nic и Dox вызывает значительную гибель всех клеток рака груди. Однако комбинация Nic и Dox была более сильной в индукции апоптоза и вызывала синергетически усиленную гибель всех клинических подтипов клеток рака молочной железы при нескольких комбинаторных концентрациях в обоих режимах лечения (последовательном и одновременном). Более того, выяснение механизма предполагает, что повышенная эффективность комбинации опосредована подавлением передачи сигналов Wnt / β-катенина, остановкой клеточного цикла в фазе G0 / G1 и увеличением генерации ROS во всех клетках рака молочной железы.
2. Материалы и методы
2.1. Культура клеток
Клетки MDA-MB-231 и SKBR3 поддерживали в среде DMEM / F12 (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc., Уолтем, Массачусетс, США) с добавлением 10% FBS (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham , Массачусетс, США), 0,1% пенициллина-стрептомицина (Hi-Media, Мумбаи, Махараштра, Индия), 0,1% амфотерицина (Hi-Media, Мумбаи, Махараштра, Индия) и 0,1% ципрофлоксацина (Ranbaxy Laboratories Ltd., Gurugram, Харьяна, Индия) в увлажненном инкубаторе с 5% CO 2 при 37 ° C.Клетки MCF7 поддерживали в среде DMEM (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc., Уолтем, Массачусетс, США) с добавлением 10% FBS (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc., Уолтем, Массачусетс, США) и 1% пенициллин-стрептомицина ( Hi-Media, Mumbai, Maharashtra, India) в увлажненном инкубаторе с 5% CO 2 при 37 ° C. Клеточные линии, использованные в исследовании, были протестированы на отсутствие контаминации микоплазмами и подтверждены морфологическим наблюдением. Все эксперименты проводили через 24 часа после посева клеток, если не указано иное.
2.2. Анализ цитотоксичности никлозамида (Nic) и доксорубицина (Dox) по отдельности
Для оценки цитотоксичности только Nic и Dox клеточные линии рака молочной железы MDA-MB-231, SKBR3 и MCF7 высевали в 96-луночный планшет для культивирования клеток с плотностью 5000 клеток / лунку обрабатывали различными концентрациями Nic и Dox индивидуально в течение 24 и 48 часов в полной среде для культивирования клеток. Исходный материал Dox был изготовлен в физиологическом растворе, а исходный раствор Nic был изготовлен в DMF. Соответствующие средства контроля носителя сохраняли в случае Nic, и максимальная использованная концентрация носителя составляла 0.1%. После обработки жизнеспособность клеток оценивали с помощью анализа резазурина. При этом клетки инкубировали с реагентом резазурина (Sigma Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) в полной среде при концентрации 0,02 мг / мл в течение 5 часов, а затем измеряли флуоресценцию при возбуждении 540 нм и испускании 600 нм. нм с использованием многорежимного планшет-ридера (Synergy h5, BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA). Данные анализировали как процент жизнеспособности по отношению к необработанному контролю. Значения IC 50 были рассчитаны с помощью нелинейного регрессионного анализа в Prism (версия 6.01, программное обеспечение GraphPad).
2.3. Анализ цитотоксичности комбинации никлозамида (Nic) и доксорубицина (Dox)
Для оценки цитотоксичности комбинации Nic и Dox использовали протокол, аналогичный описанному выше для анализа цитотоксичности отдельного лекарственного средства. Вкратце, 5000 клеток / лунку, посеянные в 96-луночном планшете для культивирования клеток, обрабатывали различными концентрациями Nic и Dox последовательно (Nic в течение 24 часов, затем Dox в течение еще 24 часов) и одновременно (Nic и Dox вместе в течение 48 часов). схемы лечения и цитотоксичность комбинации оценивали с помощью анализа резазурина.Для расчета индекса комбинации различных комбинаторных концентраций, во-первых, ингибирующие концентрации отдельных лекарств (IC F ) были рассчитаны с использованием следующего уравнения (известного как IC any ; получено из нелинейного регрессионного анализа кривой доза-ответ в Prism, программное обеспечение Graph Pad)ICF = F100 − F1 / H × IC50
(1)
где:IC F = ингибирующая концентрация отдельного лекарственного средства (Nic или Dox), необходимая для того, чтобы вызвать такой же процент гибели клеток, который вызван комбинацией лекарств (Nic и Dox).
F = процент жизнеспособных клеток, оставшихся после обработки комбинацией (последовательной или одновременной) Nic и Dox.
100-F = процент мертвых клеток после обработки комбинацией (последовательной или одновременной) Nic и Dox.
H = наклон нелинейной регрессии кривой цитотоксичности отдельного лекарственного средства.
IC 50 = ингибирующая концентрация отдельного лекарственного средства, необходимая для того, чтобы вызвать гибель 50% клеток.
CIF = NicFcomboICFNic + DoxFcomboICFDox
(2)
где:CI (F) = индекс комбинации комбинации Nic и Dox, который вызвал (100-F) процент гибели клеток.
Nic (Fcombo) = концентрация Nic, необходимая для того, чтобы вызвать (100-F) процент гибели клеток при использовании в комбинации.
Dox (Fcombo) = концентрация Dox, необходимая для того, чтобы вызвать (100-F) процент гибели клеток при использовании в комбинации.
Чтобы улучшить ясность и выделить тенденции в данных, жизнеспособность клеток, а также данные CI были нанесены на график в двух форматах (тепловые карты и линейные графики). Все анализы были выполнены с использованием средних значений, определенных из трех экспериментальных повторов.
2.4. Анализ апоптоза
Анализ апоптоза выполняли в клетках, обработанных выбранными дозами Nic и Dox, с использованием Muse ® Annexin V и набора Dead Cell (Merck, Millipore, Burlington, MA, USA) в соответствии с протоколом производителя.Вкратце, обработанные клетки промывали однократным фосфатным буферным солевым раствором (PBS), обрабатывали трипсином и переносили в микроцентрифужные пробирки на 1,5 мл. Сто микролитров клеточной суспензии смешивали со 100 мкл Muse ® Annexin V и реагентом Dead Cell и инкубировали в течение 20 минут при комнатной температуре (RT) в темноте. Позже клетки анализировали в анализаторе клеток Guava ® Muse ® Cell Analyzer (Merck, Millipore, Берлингтон, Массачусетс, США).
2.5. Иммунофлуоресцентное окрашивание
Для иммуноокрашивания β-катенина клетки рака груди, посеянные на покровные стекла, обрабатывали Nic в течение 24 и 48 часов.После обработки клетки фиксировали 4% формальдегидом и блокировали в течение 2 ч при комнатной температуре. Позже клетки инкубировали с первичным антителом против β-катенина (Sino Biological, Пекин, Китай) в течение 2 часов при комнатной температуре, трижды промывали 1X PBS, а затем инкубировали с вторичным антителом против кролика в течение 2 часов при комнатной температуре. Наконец, клетки окрашивали ядерным красителем DAPI (Sigma Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) в течение 10 мин при комнатной температуре и наносили противозатухающий агент DABCO (Sigma Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США). Затем клетки визуализировали с помощью конфокального микроскопа (LSM780NLO, Carl Zeiss, GmbH-).Ядерную транслокацию β-катенина количественно оценивали с использованием программного обеспечения MATLAB.
2.6. Анализ экспрессии генов с помощью RT-PCR
Анализ экспрессии генов различных сигнальных маркеров Wnt выполняли во всех линиях клеток рака молочной железы после обработки выбранными концентрациями Nic отдельно или в комбинации с Dox с помощью кПЦР в реальном времени. Полную РНК экстрагировали с использованием реагента TRI ® (Sigma Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) в соответствии с протоколом производителя.Вкратце, обработанные клетки трипсинизировали и лизировали 700 мкл ТРИЗОЛА с последующим добавлением 140 мкл хлороформа и центрифугированием при 13000 об / мин при 4 ° C в течение 15 минут. Водную фазу, полученную после центрифугирования, переносили пипеткой в свежие микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл и осаждали общую РНК, добавляя равный объем изопропанола, с последующим центрифугированием при 13000 об / мин в течение 15 минут при 4 ° C. Полученный осадок РНК дважды промывали 75% охлажденным этанолом и давали высохнуть при 37 ° C для удаления избытка этанола.Высушенный осадок ресуспендировали в воде, свободной от РНКазы, и количественно определяли общую РНК с помощью Nanodrop (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Комплементарную ДНК (кДНК) синтезировали из 500 нг общей РНК с использованием набора для обратной транскрипции кДНК (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA) в соответствии с протоколом производителя. Затем количественную ПЦР проводили в StepOne Plus RT-PCR (Applied Biosystems, Уолтем, Массачусетс, США) с использованием SYBR Green Master Mix. Относительную экспрессию целевого гена рассчитывали с использованием метода ΔΔCt путем нормализации Ct целевого гена к среднему Ct гена домашнего хозяйства GAPDH.Кратность изменения экспрессии целевого гена рассчитывалась как 2 (-ΔΔCt) по сравнению с необработанными контролями. Используемые последовательности праймеров перечислены в таблице S1.2.7. Анализ клеточного цикла
Анализ клеточного цикла был проведен во всех клетках рака груди после индивидуального и комбинированного (последовательного и одновременного) лечения Nic и Dox с использованием набора Muse ® Cell cycle kit (Merck, Millipore, Burlington, MA, USA) в соответствии с протоколу производителя. Вкратце, обработанные клетки трипсинизировали, переносили в 1.Микроцентрифужные пробирки на 5 мл и осаждали. Осадки клеток промывали 1X PBS и ресуспендировали в 50 мкл 1X PBS. Ресуспендированные клетки добавляли по каплям в пробирку, содержащую 1 мл ледяного 70% этанола, и оставляли не менее чем на 3 часа для фиксации при -20 ° C. Клетки, фиксированные этанолом, центрифугировали и дважды промывали 1X PBS. Наконец, клетки ресуспендировали в 200 мкл реагента для клеточного цикла Muse ® и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре, а затем анализировали в анализаторе клеток Guava ® Muse ® (Merck, Millipore, Берлингтон, Массачусетс, США).
2,8. Анализ активных форм кислорода (ROS)
клеток, обработанных Nic и Dox, анализировали на ROS с использованием реагентов DCFDA (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) и DHE (Abcam, Cambridge, MA, USA) в соответствии с протоколом производителя. В анализе DCFDA клетки инкубировали с 50 мкМ реагента DCFDA в HBSS в течение 45 мин в инкубаторе для культур клеток CO 2 при 37 ° C. После этого клетки повторно промывали HBSS и обрабатывали Nic и Dox в течение 4 часов и 8 часов в HBSS, содержащем 10% FBS.Затем флуоресценцию измеряли с использованием многорежимного планшет-ридера (Synergy, Hybrid h5, BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA) без удаления обработки при возбуждении 485 нм и эмиссии 535 нм.
В анализе DHE засеянные клетки обрабатывали Nic и Dox в течение 4 часов и 8 часов в HBSS, содержащем 10% FBS. За час до завершения обработки в каждую лунку добавляли 20 мкМ реагента DHE. Позже обработки вместе с DHE были заменены буфером HBSS, и сигнал флуоресценции был немедленно измерен с помощью многорежимного планшет-ридера (Synergy, Hybrid h5, BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA) при возбуждении 500 нм и эмиссии 590 нм.
2.9. Статистический анализ
Каждый эксперимент повторяли не менее трех раз (биологический повтор) с не менее чем тремя техническими повторениями. Если не указано иное, результаты были представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (S.E.M). Для сравнения двух групп использовался t-критерий Стьюдента (непарный и двусторонний). Односторонний дисперсионный анализ ANOVA использовался для множественных сравнений (когда сравнивалось более двух групп). Двусторонний дисперсионный анализ был использован для множественных сравнений (когда сравнивались несколько групп и два параметра).Все статистические анализы проводились с помощью Prism (версия 6.01, GraphPad Software). Значение вероятности (p) менее 0,05 (p <0,05) считалось статистически значимым.
4. Обсуждение
Сложность ракового генома, гетерогенность раковых клеток и микроокружения опухоли, а также устойчивость к противораковым лекарствам сделали терапию одним агентом неэффективной [23]. Как следствие, существует неудовлетворенная потребность в разработке эффективной комбинированной терапии с клинически значимыми мишенями и соответствующими нацеливающими агентами.В этом отношении сигнальные пути клеток привлекают большое внимание, поскольку аберрантно экспрессируемые сигнальные пути действуют как основные движущие силы рака. Они не только способствуют развитию устойчивости к данной терапии, но также ответственны за молекулярную гетерогенность раковой популяции и онкогенную сигнатуру раковых клеток [4]. Wnt / β-катенин является одним из таких аберрантно экспрессируемых сигнальных путей при раке молочной железы, который, как было установлено, связан с усиленным онкогенезом, инвазией и химиорезистентностью раковых клеток [24].Следовательно, комбинаторный подход нацеливания передачи сигналов Wnt в сочетании с обычным противораковым агентом может улучшить терапевтический результат. Nic показал многообещающее ингибирование передачи сигналов Wnt во многих доклинических исследованиях при множественных типах рака [25]. Таким образом, в настоящем исследовании мы разработали комбинированную терапию на основе Nic и Dox, которая до сих пор не использовалась для лечения рака. Хотя Dox является стандартом лечения рака груди в клинике [26], высокие дозировки и неспецифическое биораспределение Dox могут вызывать серьезные опасные для жизни побочные эффекты, такие как кардиотоксичность [27,28].Поэтому желательно снизить концентрацию Докса, необходимую для эффективной терапии. С этой целью мы использовали Nic для нацеливания передачи сигналов Wnt, тем самым увеличивая возможность улучшения терапевтической эффективности Dox при более низких концентрациях, получая дополнительное преимущество в виде подавления передачи сигналов Wnt. Анализ цитотоксичности показал, что отдельные Nic и Dox вызывают значительную цитотоксичность для рака молочной железы. клетки. Однако разные клинические подтипы клеток рака груди реагировали с разной чувствительностью к Nic и Dox.Из всех трех подтипов клетки MDA-MB-231 проявляли значительно меньшую чувствительность к обоим препаратам и имели самые высокие значения IC 50 , клетки SKBR3 были относительно более чувствительны и имели самые низкие значения IC 50 , тогда как клетки MCF7 имели промежуточная чувствительность трех клинических подтипов, за исключением 48 ч IC 50 Nic, которая была самой низкой для клеток MCF7. Позже анализ цитотоксичности комбинаторных схем продемонстрировал, что как последовательные (Nic → Dox), так и одновременные (Nic + Dox) комбинации Nic и Dox более эффективны в подавлении роста клеток рака груди при концентрациях, намного меньших, чем их соответствующие IC 50 ценности.Известно, что два препарата обладают синергическим действием при ДИ 18]. На основании расчета индексов комбинации несколько комбинаций были синергетическими в обоих режимах лечения в клетках MDA-MB-231 и SKBR3. В клетках MCF7, хотя как последовательные, так и одновременные комбинаторные концентрации вызывали значительную гибель клеток, комбинации были синергичными только при последовательной терапии, так как в параллельном режиме цитотоксические комбинаторные пары были связаны со значениями CI больше 1. Таким образом, степень синергизма варьировалась. между подтипами.Интересно, что линия клеток TNBC MDA-MB-231, которая имела наименьшую чувствительность к отдельным лекарственным средствам, продемонстрировала самую высокую чувствительность и синергизм против обоих режимов комбинаторного лечения среди всех подтипов. Это интересно, поскольку TNBC, в котором отсутствует какая-либо таргетная терапия, является подтипом рака груди, который наиболее трудно лечить в клинике. С другой стороны, HER2-положительная линия клеток рака молочной железы SKBR3, которая продемонстрировала наивысшую чувствительность к отдельным лекарствам через 24 часа, имела самую низкую чувствительность и синергизм в последовательной схеме лечения.Кроме того, HR-положительная клеточная линия MCF7 показала лучшую чувствительность к последовательной комбинации по сравнению с клетками SKBR3; однако, несмотря на наивысшую чувствительность к Nic через 48 ч, он не показал эффективного синергизма в отношении одновременного лечения. В совокупности мы наблюдали подтип-зависимую эффективность комбинации Nic и Dox, которую можно отнести к молекулярным различиям в этих клинических подтипах [29]. Примечательно, что в рамках подтипа график лечения, время инкубации и концентрации являются важными факторами, поскольку их вариации приводят к изменениям синергизма.Кроме того, традиционные методы анализа комбинаторной эффективности чаще всего включают расчет комбинированного индекса для 50% гибели клеток или использование фиксированных комбинаторных соотношений [30,31,32,33]. Однако мы проверили многие комбинаторные концентрации Nic и Dox в большом количестве соотношений и рассчитали индексы комбинации для всех протестированных комбинаций. Это обеспечивает более всестороннее исследование, поскольку оно включает больший охват концентраций и соотношений. Кроме того, исследование также подчеркивает важность регулирования концентраций и соотношений Nic и Dox для достижения синергизма, поскольку небольшое количество концентраций и соотношений приводило к аддитивным или антагонистическим эффектам.Однако несинергические концентрации и соотношения больше не рассматривались из-за отсутствия у них терапевтического потенциала. Таким образом, это исследование продемонстрировало важность всестороннего анализа, позволяющего выбрать подходящий график лечения, время инкубации, а также концентрации Nic и Dox, которые будут использоваться для эффективной комбинированной терапии. Впоследствии, чтобы расшифровать механизм синергизма между Nic и Dox, одна синергетическая пара Nic и Dox (с промежуточными концентрациями Nic и низкими концентрациями Dox) была выбрана для каждого подтипа рака груди.Во-первых, был исследован режим цитотоксичности раковых клеток, и результаты показали, что повышенная цитотоксичность комбинации Nic и Dox как в последовательном, так и в параллельном режимах действительно опосредована апоптозом. Основываясь на исследованиях жизнеспособности клеток и апоптоза, можно сделать вывод, что лечение Nic сенсибилизировало клетки рака молочной железы по отношению к Dox, и, как следствие, комбинация независимо от режима (Nic → Dox и Nic + Dox) приводила к усилению цитотоксичности, опосредованной апоптозом.Кроме того, поскольку ожидается, что подавление передачи сигналов Wnt увеличит чувствительность Dox к раковым клеткам [34], передачу сигналов Wnt исследовали после лечения Nic. Для последовательной терапии (Nic → Dox) раковые клетки инкубировали с Nic в течение 24 часов, а для параллельной терапии (Nic + Dox) клетки подвергали воздействию Nic в течение 48 часов. Результаты, полученные для маркеров передачи сигналов Wnt LEF, TCF, cMYC и CCND1 с помощью ОТ-ПЦР и β-катенина с помощью иммуноокрашивания, предполагают, что Nic эффективно подавляет передачу сигналов Wnt в клетках рака молочной железы в обоих режимах с большей подавляющей регуляцией, наблюдаемой с увеличением продолжительности действия экспозиция.Поскольку последовательный режим включает предварительное воздействие Nic для сенсибилизации клеток к Dox, вероятность того, что Dox будет влиять на Nic, не существует. Однако в параллельном режиме клетки одновременно подвергаются воздействию Nic и Dox, что приводит к возможности вмешательства Dox в активность Nic. Поэтому передачу сигналов Wnt также исследовали в клетках MDA-MB-231 и SKBR3 после совместной инкубации с обоими агентами, чтобы понять, мешает ли Dox активности Nic в режиме Nic + Dox.Результаты RT-PCR показали, что Nic значительно подавляет передачу сигналов Wnt также в присутствии Dox. Это доказывает, что Dox не оказывает отрицательного влияния на активность Nic, что важно для эффективности одновременного комбинированного режима. Кроме того, данные RT-PCR показали, что среди других генов-мишеней Wnt, Nic также подавляет CyclinD1 (CCND1), который способствует фазовому переходу G0 / G1 в S в клеточном цикле. Таким образом, фазовое распределение клеточного цикла оценивалось после индивидуальной обработки Nic (как при последовательной терапии Nic → Dox, клетки сначала инкубировали с Nic только в течение 24 часов), а также одновременной обработки (Nic + Dox).Наблюдалось значительное увеличение процента клеток, арестованных в фазе G0 / G1 после обработки Nic в течение 24 часов, по сравнению с контролем в клетках MDA-MB-231 и MCF7. В случае клеток SKBR3 обработка Nic вызывала значительное подавление передачи сигналов Wnt, включая подавление CyclinD1. Однако не было значительной разницы в процентном содержании клеток, арестованных в фазе G0 / G1 в группе, обработанной Nic, по сравнению с группой, не получавшей лечения. Это может быть связано с другими параллельными сигнальными путями, работающими в раковых клетках, и требует дальнейшего изучения.Это означает, что подавление CyclinD1 привело к остановке клеточного цикла клеток рака груди в фазе G0 / G1 их клеточного цикла. Более того, индивидуальная обработка Dox приводила к значительному снижению процентного содержания клеток в G0 / G1 по сравнению с контрольной группой и группами Nic и к значительному увеличению количества клеток в фазе G2 / M по сравнению с контрольными группами, группами Nic и Nic + Dox. Предыдущие исследования также продемонстрировали, что Nic вызывает остановку клеток в фазе G0 / G1 клеточного цикла [35,36], а Dox вызывает остановку клеток в фазе G2 / M клеточного цикла в клетках млекопитающих [37,38].Однако группы Nic + Dox вызывали значительное увеличение количества клеток в фазе G0 / G1 по сравнению с группой Dox, хотя это число было ниже по сравнению с группой, получавшей только Nic. Это означает, что присутствие Nic в сопутствующей терапии (Nic + Dox) вызывало значительное увеличение количества клеток G0 / G1 по сравнению с группой Dox, подтверждая, что подавление CyclinD1 привело к остановке клеточного цикла в Nic + Dox. также лечение, что в конечном итоге повысило эффективность этого режима.Известно, что контрольные точки клеточного цикла восстанавливают поврежденную ДНК и что клетки вступают в путь апоптоза, если поврежденная ДНК не восстанавливается должным образом [39,40]. Исследования показывают, что клетки в контрольной точке G1 имеют пониженную способность восстанавливать двухцепочечные разрывы ДНК (DSB) по сравнению с контрольной точкой G2 [41]. Это так, потому что контрольная точка G1 имеет только одну копию каждой хроматиды и, следовательно, негомологичное соединение концов ДНК (NHEJ) является первичным путем репарации DSBs в контрольной точке G1 [42]. Поскольку NHEJ подвержен ошибкам, репарация ДНК менее эффективна в контрольной точке G1 [43].С другой стороны, контрольная точка G2 имеет две сестринские хроматиды, следовательно, одна сестринская хроматида может участвовать в репарации другой поврежденной хроматиды. Следовательно, в контрольной точке G2, DSBS в первую очередь восстанавливаются с помощью пути гомологичной рекомбинации (HR), который является безошибочным путем [44]. Следовательно, в совокупности репарация ДНК в контрольной точке G1 развития клеточного цикла менее эффективна и может быть ошибочной по сравнению с контрольной точкой G2. Это говорит о том, что клетки, задержанные в фазе G0 / G1, более склонны к апоптозу, если они сталкиваются с состоянием повреждения ДНК, которое генерирует DSB.Генерация активных форм кислорода (АФК) является одним из таких состояний повреждения ДНК, которое генерирует DSB [43,45]. В предыдущих исследованиях сообщалось о генерации АФК Доксом, а также Ником [22,46]. Поскольку клетки рака молочной железы, обработанные комбинацией Nic и Dox (независимо от режима), имели значительно большее количество клеток в фазе G0 / G1, был исследован вклад ROS в значительно усиленный апоптоз раковых клеток. Результаты показали, что как Nic, так и Dox генерировали значительно большее количество ROS, которое, по крайней мере, вдвое превышало количество, присутствующее в необработанной контрольной группе, за 8 часов исследования.Предыдущие исследования показали, что такие высокие уровни АФК токсичны для клеток [47]. Таким образом, результаты свидетельствуют о том, что АФК, генерируемые Nic и Dox, могут быть одним из важных факторов, вызывающих повышенную гибель клеток рака молочной железы в обоих комбинированных режимах. Взятые вместе, результаты предполагают следующий механизм синергизма в комбинированных режимах. При последовательной терапии (Nic → Dox) Nic вызывает значительное подавление передачи сигналов Wnt, что делает раковые клетки химиочувствительными и менее онкогенными.Кроме того, обработка Nic вызвала остановку клеточного цикла в фазе G0 / G1, что сделало эти клетки более склонными к апоптозу в случае состояния повреждения ДНК. Инкубация таких химиочувствительных и G0 / G1-арестованных клеток с Dox приводила к значительно более высокому апоптозу из-за повышенной собственной цитотоксичности Dox, а также к генерации большого количества ROS (рис. 8). При одновременной терапии (Nic + Dox) Nic вызывает большее подавление передачи сигналов Wnt и, как следствие, остановку клеточного цикла в фазе G0 / G1.Одновременное присутствие Dox вызывало повышенную гибель химиочувствительных раковых клеток, а также клеток, задержанных G0 / G1, за счет генерации большого количества ROS (рис. 8). Кроме того, крайне маловероятно, что все раковые клетки в микроокружении опухоли будут иметь сходный и синхронизированный ответ на проводимое лечение, поскольку хорошо известно, что популяция раковых клеток очень гетерогена с точки зрения их ответов на терапию, а также их онкогенные свойства. Следовательно, можно ожидать, что последовательная терапия может вызвать более медленное уменьшение опухоли и снижение токсичности вне мишени, тогда как одновременное присутствие Nic и Dox может вызвать более быстрое уменьшение опухоли; однако в этом случае нагрузка нецелевой токсичности также будет выше.В совокупности выбор схемы лечения будет зависеть от пациента и характеристик опухоли. Более того, это исследование продемонстрировало эффективность комбинации Nic и Dox в обеих схемах лечения рака груди. Однако эта комбинация может быть исследована для нескольких типов рака, которые характеризуются дисрегулируемой передачей сигналов Wnt, таких как колоректальный рак, рак простаты, рак легких, рак яичников, лейкемия и глиобластома [11,48].Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie
Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности.Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.
Настройка вашего браузера для приема файлов cookie
Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:
- В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
- Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
- Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
- Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
- Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.
Почему этому сайту требуются файлы cookie?
Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.
Что сохраняется в файле cookie?
Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.
Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.
Качественная характеристика митохондриального липидома печени крысы с использованием профилирования ЖХ-МС и высокоэнергетической столкновительной диссоциации (HCD) Все ионные фрагменты
Bhuiyan, A.К., Джексон, С., Тернбулл, Д. М., Эйнсли-Грин, А.,
Леонард, Дж. В., и Бартлетт, К. (1992). Измерение
карнитина и ацил-карнитинов: Применение к исследованию
пациентов с подозрением на наследственные нарушения митохондриального окисления жирных кислот
. Clinica Chimica Acta, 207 (3), 185–204.
Берд, С. С., Марур, В. Р., Снятински, М. Дж., Гринберг, Х. К., &
Кристал, Б. С. (2011a). Липидомическое профилирование с помощью высокого разрешения
ЖХ-МС и высокоэнергетическая коллизионная диссоциационная фрагментация:
Сосредоточение внимания на характеристике митохондриальных кардиолипинов и
монолизокардиолипинов.Аналитическая химия, 83 (3), 940–949.
Берд, С. С., Марур, В. Р., Снятински, М. Дж., Гринберг, Х. К., &
Кристал, Б. С. (2011b). Липидомический профиль сыворотки с использованием LC-MS
и высокоэнергетической коллизионной диссоциативной фрагментации: основное внимание уделяется обнаружению и характеристике триглицеридов
. Analytical Chemis-
try, 83 (17), 6648–6657.
Блай, Э. Г., и Дайер, У. Дж. (1959). Экспресс-метод экстракции и очистки общего липида
.Канадский журнал биохимии
и физиологии, 37 (8), 911–917.
Bou Khalil, M., Hou, W., Zhou, H., Elisma, F., Swayne, L.A.,
Blanchard, A.P., et al. (2009). Эпоха липидомики: Выполнить –
задач и задач. Mass Spectrometry Reviews, 29 (6),
877–929.
Берк, В. Дж., Кристал, Б. С., Ю, Б. П., Ли, С. В., и Лин, Т. С. (1998).
Метаболит медиатора норэпинефрина генерирует свободные радикалы
и активирует переход митохондриальной проницаемости: механизм
-низма для апоптоза, индуцированного ДОПЕГАЛом.Brain Research, 787 (2),
328–332.
Cequier-Sanchez, E., Rodriguez, C., Ravelo, A. G., & Zarate, R.
(2008). Дихлорметан как растворитель для экстракции липидов и
оценка классов липидов и жирных кислот из образцов
различной природы. Журнал сельскохозяйственной и пищевой химии,
56 (12), 4297–4303.
Чен, Дж. Дж., И Ю, Б. П. (1994). Изменение текучести митохондриальной мембраны
продуктами перекисного окисления липидов.Free Radical
Биология и медицина, 17 (5), 411–418.
Chicco, A. J., & Sparagna, G. C. (2007). Роль кардиолипина
изменений в митохондриальной дисфункции и болезни. Американский
Журнал физиологии – физиология клетки, 292 (1), C33 – C44.
Крейн, Ф. Л. (2007). Открытие убихинона (коэнзима Q) и обзор функций
. Митохондрия, 7 (Suppl), S2 – S7.
Деннис, Э. А. (2009). Липидомика присоединяется к эволюции омиков.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United
States of America, 106 (7), 2089–2090.
Ди Паола, М., Кокко, Т., и Лоруссо, М. (2000). Взаимодействие церамидов
с дыхательной цепью митохондрий сердца. Биохимия,
39 (22), 6660–6668.
Эйсинг, К.С., Меринг, Т., Бахр, У., Духослав, Э., Карас, М.,
Саймонс, К. и др. (2006). Путь индуцированной столкновением диссоциации –
пути дрожжевых сфинголипидов и их молекулярное профилирование всего
липидных экстрактов: исследование квадрупольной TOF и линейной ионной ловушкой –
орбитальная масс-спектрометрия.Журнал масс-спектрометрии и
Ion Physics, 41 (3), 372–389.
Эйсинг, К.С., Сампайо, Дж. Л., Сурендранат, В., Духослав, Э.,
Экроос, К., Клемм, Р. В. и др. (2009). Общий анализ липидома дрожжей
методом количественной масс-спектрометрии.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United
States of America, 106 (7), 2136–2141.
Эстербауэр, Х., Шаур, Р. Дж., И Цолльнер, Х. (1991). Химия и
биохимия 4-гидроксиноненаля, малонового альдегида и родственных
альдегидов.Свободная радикальная биология и медицина, 11 (1), 81–128.
Фахи, Э., Субраманиам, С., Браун, Х. А., Гласс, К. К., Меррилл, А. Х.,
-младший, Мерфи, Р. К. и др. (2005). Комплексная классификация
липидов. Журнал исследований липидов, 46 (5), 839–861.
Фахи, Э., Суд, М., Коттер, Д., и Субраманиам, С. (2007). LIPID
Онлайн-инструменты MAPS для исследования липидов. Nucleic Acids Research,
35 (выпуск веб-сервера), W606 – W612.
Гудзь, Т.И., Цернг, К. Ю., и Хоппель, К. Л. (1997). Прямое ингибирование
комплекса III дыхательной цепи митохондрий клеточно-проницаемым церамидом
. Журнал биологической химии, 272 (39),
24154–24158.
Хан, X., & Гросс, Р. У. (2003). Общий анализ клеточных липидомов
непосредственно из неочищенных экстрактов биологических образцов методом масс-спектрометрии ESI
: мост к липидомике. Журнал исследований липидов,
44 (6), 1071–1079.
Хан, X., & Гросс, Р. У. (2005). Липидомика дробовика: Electrospray
, ионизационный масс-спектрометрический анализ и количественное определение
клеточных липидомовнепосредственно из сырых экстрактов биологических образцов
. Масс-спектрометрия. Обзоры, 24 (3), 367–412.
Хан, X., Янг, Дж., Ченг, Х., Ян, К., Abendschein, D. R., & Gross,
R. W. (2005). Липидомия дробовика идентифицирует истощение кардиолипина
в диабетическом миокарде, связывая измененное использование субстрата с митохондриальной дисфункцией
.Биохимия, 44 (50), 16684–16694.
Хан, X., Ян, К., Ян, Дж., Ченг, Х., и Гросс, Р. У. (2006).
Дробовая липидомика молекулярных форм кардиолипина в липидах
экстрактов биологических образцов. Журнал исследований липидов, 47 (4),
864–879.
Ханнун, Ю. А., и Обейд, Л. М. (2002). Церамид-ориентированная вселенная липид-опосредованной регуляции клеток
: стрессовые столкновения
липидного типа. Журнал биологической химии, 277 (29),
25847–25850.
Hu, C., van Dommelen, J., van der Heijden, R., Spijksma, G.,
Reijmers, T.H., Wang, M., et al. (2008). RPLC-ion-trap-FTMS
метод определения липидного профиля плазмы: валидация метода и применение
к модели мутантных мышей p53. Journal of Proteome
Research, 7 (11), 4982–4991.
Кибиш, М.А., Хан, X., и Сейфрид, Т.Н. (2009). Исследование митохондриального липидома мозга
с использованием липидомики дробовика. Методы
в молекулярной биологии, 579, 3–18.
Красников Б.Ф., Ким С.Ю., МакКонуги С.Дж., Рю Х., Сюй Х.,
Ставровская И. и др. (2005). Активность трансглутаминазы составляет
, присутствующих в высокоочищенном несинаптосомном мозге мышей и
митохондриях печени. Биохимия, 44 (21), 7830–7843.
Кристал, Б. С., Конвей, А. Д., Браун, А. М., Джайн, Дж. К., Уллучи, П. А.,
Ли, С. В. и др. (2001). Избирательная дофаминергическая уязвимость:
3,4-дигидроксифенилацетальдегид нацелен на митохондрии.Бесплатно
Радикальная биология и медицина, 30 (8), 924–931.
Кристал, Б. С., Парк, Б. К., и Ю, Б. П. (1996). 4-гидроксигексенал является мощным индуктором перехода митохондриальной проницаемости.
Журнал биологической химии, 271 (11), 6033–6038.
Лэнд, Дж. М., Морган-Хьюз, Дж. А., Харгривз, И., & Хилс, С. Дж.
(2004). Митохондриальная болезнь: историческая, биохимическая и
Лондонская перспектива. Нейрохимические исследования, 29 (3), 483–491.
Ланг, Дж. К., & Пакер, Л. (1987). Количественное определение
витамина Е и окисленного и восстановленного кофермента Q с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии
с проточным ультрафиолетовым и электрохимическим детектированием
. Журнал хроматографии, 385,
109–117.
Леназ, Г. (1988). Роль подвижности редокс-компонентов во внутренней митохондриальной мембране
. Журнал мембранной биологии, 104 (3),
193–209.
Леназ, Г., Фато Р., Формиджини Г. и Генова М. Л. (2007). Роль
кофермента Q в митохондриальном транспорте электронов. Митохон-
drion, 7 (Suppl), S8 – S33.
Ли, М., Чжоу, З., Ни, Х., Бай, Ю., и Лю, Х. (2010). Последние достижения
хроматографии и масс-спектрометрии в липидомике. Ана-
литическая и биоаналитическая химия, 399 (1), 243–249.
Лоури, О. Х., Роузбро, Н. Дж., Фарр, А. Л., и Рэндалл, Р. Дж. (1951).
Измерение белка с фенольным реагентом Folin.Журнал
Биологическая химия, 193 (1), 265–275.
Маккензи М., Лиолица Д. и Ханна М. Г. (2004). Митохондриальная болезнь
: мутации и механизмы. Нейрохимические исследования,
29 (3), 589–600.
S. S. Bird et al.
123
Накопление модифицированного изолевугландином белка в нормальном и фиброзном легких
Брэйм, К. Дж., Саломон, Р. Г., Морроу, Дж. Д. и Робертс, Л. Дж., 2-й. Идентификация чрезвычайно реактивных гамма-кетоальдегидов (изолевугландинов) как продуктов пути изопростана и характеристика их аддуктов лизилового белка. J Biol Chem 274 , 13139–13146 (1999).
CAS Статья Google ученый
Саломон, Р. Г. и Би, В. Аддукты изолевугландина при болезни. Антиоксидный окислительно-восстановительный сигнал 22 , 1703–1718, DOI: 10.1089 / ars.2014.6154 (2015).
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
Дэвис, С.S. et al. Обработка поглотителем гамма-кетоальдегида предотвращает дефицит рабочей памяти у мышей hApoE4. J Alzheimers Dis 27 , 49–59, DOI: 10.3233 / JAD-2011-102118 (2011).
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
Kirabo, A. et al. Изокетально-модифицированные белки DC активируют Т-клетки и способствуют гипертонии. J Clin Invest 124 , 4642–4656, DOI: 10.1172 / JCI74084 (2014).
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
Roychowdhury, S. et al. Образование аддуктов гамма-кетоальдегид-белок при повреждении печени у мышей, вызванном этанолом. Free Radic Biol Med 47 , 1526–1538, DOI: 10.1016 / j.freeradbiomed.2009.07.015 (2009).
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
Bernoud-Hubac, N.и другие. Низкие концентрации реактивных гамма-кетоальдегидов стимулируют тромбоксан-зависимую агрегацию тромбоцитов человека посредством активации p38-MAPK. Biochim Biophys Acta 1791 , 307–313, DOI: 10.1016 / j.bbalip.2009.02.003 (2009).
Nakajima, T. et al. Селективные поглотители гамма-кетоальдегида защищают Nav1.5 от инактивации, вызванной окислителями. J Mol Cell Cardiol 48 , 352–359, DOI: 10.1016 / j.yjmcc.2009.11.016 (2010).
CAS Статья PubMed Google ученый
Мияшита, Х.и другие. Пирролизин лизина – это встречающаяся в природе ковалентная модификация, участвующая в производстве белков, имитирующих ДНК. Научный представитель 4 , 5343, DOI: 10.1038 / srep05343 (2014).
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
Лето, Т. Л., Моран, С., Херт, Д. и Уэяма, Т. Нацеливание и регулирование образования активных форм кислорода с помощью НАДФН-оксидаз семейства Nox. Антиоксидный окислительно-восстановительный сигнал 11 , 2607–2619, DOI: 10.1089 / ARS.2009.2637 (2009).
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
Kim, H.G. et al. Эндосульфан индуцирует экспрессию ЦОГ-2 через НАДФН-оксидазу и пути ROS, MAPK и Akt. Arch Toxicol 89 , 2039–2050, DOI: 10.1007 / s00204-014-1359-7 (2015).
CAS Статья PubMed Google ученый
Санчо, П., Martin-Sanz, P. & Fabregat, I. Взаимная регуляция НАДФН-оксидаз и пути циклооксигеназы-2. Free Radic Biol Med 51 , 1789–1798, DOI: 10.1016 / j.freeradbiomed.2011.08.011 (2011).
CAS Статья PubMed Google ученый
Cachat, J., Deffert, C., Hugues, S. & Krause, K.H. НАДФН-оксидаза фагоцитов и специфический иммунитет. Clin Sci (Лондон) 128 , 635–648, DOI: 10.1042 / CS20140635 (2015).
CAS Статья Google ученый
Родитель, Р. А. Сравнительная биология нормального легкого, 2-е издание. 491–492 (2015).
Moi, P., Chan, K., Asunis, I., Cao, A. & Kan, YW Выделение фактора 2, связанного с NF-E2 (Nrf2), основной лейциновой молнии, подобной NF-E2 активатор транскрипции, который связывается с тандемным повторением NF-E2 / AP1 контрольной области локуса бета-глобина. Proc Natl Acad Sci USA 91 , 9926–9930 (1994).
CAS ОБЪЯВЛЕНИЯ Статья Google ученый
McMahon, M. et al. Основной фактор транскрипции лейциновой молнии Nrf2 Cap’n’Collar (фактор 2, связанный с NF-E2 p45) контролирует как конститутивную, так и индуцибельную экспрессию ферментов кишечной детоксикации и биосинтеза глутатиона. Исследования рака 61 , 3299–3307 (2001).
CAS PubMed Google ученый
Тейлор Р.C., Acquaah-Mensah, G., Singhal, M., Malhotra, D. & Biswal, S. Алгоритмы сетевого вывода выясняют Nrf2-регуляцию окислительного стресса легких мышей. Plos Comput Biol 4 , e1000166, DOI: 10.1371 / journal.pcbi.1000166 (2008).
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
Kovac, S. et al. Nrf2 регулирует продукцию ROS митохондриями и NADPH-оксидазой. Biochim Biophys Acta 1850 , 794–801, DOI: 10.1016 / j.bbagen.2014.11.021 (2015).
Hirayama, A. et al. ЭПР-визуализация снижающей активности у мышей с дефицитом транскрипционного фактора Nrf2. Free Radic Biol Med 34 , 1236–1242 (2003).
CAS Статья Google ученый
Сигал, Б. Х. и др. НАДФН-оксидаза ограничивает врожденный иммунный ответ в легких у мышей. Plos One 5 , e9631, DOI: 10.1371 / journal.pone.0009631 (2010).
CAS ОБЪЯВЛЕНИЯ Статья PubMed PubMed Central Google ученый
Калаш Р. и др. Различия в транскрипции генов облученных легких мышей C57BL / 6NHsd, склонных к фиброзу, и устойчивых к фиброзу мышей C3H / HeNHsd. In vivo 28 , 147–171 (2014).
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Калаш, р.и другие. Улучшение радиационно-индуцированного фиброза легких с помощью водорастворимого бифункционального сульфоксидного смягчителя радиации (MMS350). Radiat Res 180 , 474–490, DOI: 10.1667 / RR3233.1 (2013).
CAS ОБЪЯВЛЕНИЯ Статья PubMed PubMed Central Google ученый
Citrin, D. E. et al. Роль старения пневмоцитов II типа в радиационно-индуцированном фиброзе легких. Национальный институт рака 105 , 1474–1484, DOI: 10.1093 / jnci / djt212 (2013).
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
Чжао, В. и Роббинс, М. Е. Воспаление и хронический окислительный стресс при радиационно-индуцированном позднем повреждении нормальной ткани: терапевтические последствия. Curr Med Chem 16 , 130–143 (2009).
CAS Статья Google ученый
Софи, Л.C. Радиолиз воды: влияние поверхности оксида на производство h3 под действием ионизирующего излучения. Вода 3 , 235–253 (2011).
Артикул Google ученый
Artaud-Macari, E. et al. Связанная с ядерным фактором эритроид 2 транслокация ядерного фактора 2 вызывает дедифференцировку миофибробластов при идиопатическом фиброзе легких. Антиоксидный окислительно-восстановительный сигнал 18 , 66–79, DOI: 10.1089 / ars.2011.4240 (2013).
CAS Статья PubMed Google ученый
Hecker, L. et al. Обращение вспять стойкого фиброза при старении путем нацеливания на окислительно-восстановительный дисбаланс Nox4-Nrf2. Sci Transl Med 6 , 231ra247, DOI: 10.1126 / scitranslmed.3008182 (2014).
CAS Статья Google ученый
Laleu, B. et al. Первые в своем классе мощные и биодоступные при пероральном применении ингибиторы изоформы 4 НАДФН-оксидазы (Nox4) для лечения идиопатического легочного фиброза. J Med Chem 53 , 7715–7730, DOI: 10,1021 / jm100773e (2010).
CAS Статья PubMed Google ученый
Davies, S. S. et al. Локализация изокетальных аддуктов in vivo с использованием одноцепочечного антитела. Free Radic Biol Med 36 , 1163–1174, DOI: 10.1016 / j.freeradbiomed.2004.02.014 (2004).
CAS Статья PubMed Google ученый
Ву, Дж.и другие. Активация иммунной системы, вызванная окислением сосудов, способствует развитию фиброза и гипертонии. J Clin Invest , DOI: 10.1172 / JCI80761 (2015).
Lane, K. L. et al. Окислительное повреждение – частое последствие мутаций BMPR2. Pulm Circ 1 , 72–83, DOI: 10.4103 / 2045-8932.78107 (2011).
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
Venugopal, R.& Jaiswal, A.K. Nrf1 и Nrf2 положительно и c-Fos и Fra1 отрицательно регулируют опосредованную элементом антиоксидантного ответа экспрессию гена NAD (P) H: хинон оксидоредуктазы1 человека. Proc Natl Acad Sci USA 93 , 14960–14965 (1996).
CAS ОБЪЯВЛЕНИЯ Статья Google ученый
Jones, S.A. et al. Экспрессия компонентов НАДФН-оксидазы фагоцитов в эндотелиальных клетках человека. Am J Physiol 271 , h2626–1634 (1996).
CAS PubMed Google ученый
Ми, Х., Муругануджан, А. и Томас, П. Д. ПАНТЕРА в 2013 году: моделирование эволюции функции генов и других атрибутов генов в контексте филогенетических деревьев. Nucleic Acids Res 41 , D377–386, DOI: 10.1093 / nar / gks1118 (2013).
CAS Статья Google ученый
Carrier, E.J., Zagol-Ikapitte, I., Amarnath, V., Boutaud, O. & Oates, J. A. Левугландин образует аддукты с гистоном h5 в зависимости от циклооксигеназы-2, изменяя его взаимодействие с ДНК. Биохимия 53 , 2436–2441, DOI: 10.1021 / bi401673b (2014).
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
Галлиган, Дж. Дж. И др. Стабильная аддукция гистонов 4-оксо-2-ноненалом: потенциальная связь между окислительным стрессом и эпигенетикой. J Am Chem Soc 136 , 11864–11866, DOI: 10.1021 / ja503604t (2014).
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
Коллинсон, Э., Дейнтон, Ф. С. и Кро, Дж. Влияние линейной передачи энергии на радиолиз воды и тяжелой воды. Природа 187 , 475–477 (1960).
CAS ОБЪЯВЛЕНИЯ Статья Google ученый
Балли Д.и другие. Фактор транскрипции Foxm1 необходим для фиброза легких и перехода эпителия в мезенхиму. EMBO J 32 , 231–244, DOI: 10.1038 / emboj.2012.336 (2013).
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
Филлипс, Т. Л. Ультраструктурное исследование развития лучевого поражения легкого. Радиология 87 , 49–54, DOI: 10.1148 / 87.1.49 (1966).
CAS Статья PubMed Google ученый
Адамсон, И. Ю., Боуден, Д. Х. и Вятт, Дж. П. Путь к легочному фиброзу: ультраструктурное исследование мышей и крыс после облучения всего тела и гемиторакса. Am J Pathol 58 , 481–498 (1970).
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Белый, Д.C. Гистопатологическая основа функциональных нарушений при позднем лучевом поражении различных органов. Рак 37 , 1126–1143 (1976).
CAS Статья Google ученый
Пенни Д. П. и Рубин П. Специфические ранние мелкие структурные изменения при облучении легких. Int J Radiat Oncol Biol Phys 2 , 1123–1132 (1977).
CAS Статья Google ученый
Моосави, Х.и другие. Ранняя доза-реакция на радиацию в легких: ультраструктурное исследование. Int J Radiat Oncol Biol Phys 2 , 921–931 (1977).
CAS Статья Google ученый
Fuks, Z. et al. Основной фактор роста фибробластов защищает эндотелиальные клетки от радиационно-индуцированной программируемой гибели клеток in vitro и in vivo . Cancer Res 54 , 2582–2590 (1994).
CAS PubMed Google ученый
Дэвис, С.С. Модуляция функции белков изокеталами и левугландинами Vol. 49 49–70 (Springer, 2008).
Google ученый
Sener, G. et al. Экстракт гинкго билоба защищает от окислительного повреждения органов у крыс, вызванного ионизирующим излучением. Pharmacol Res 53 , 241–252, DOI: 10.1016 / j.phrs.2005.11.006 (2006).
CAS Статья PubMed Google ученый
Трэвис, Э.L. et al. Дефицит NRF2 сокращает продолжительность жизни мышей, получавших торакальное облучение. Free Radic Biol Med 51 , 1175–1183, DOI: 10.1016 / j.freeradbiomed.2011.05.038 (2011).
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
Davies, S. S. et al. Влияние реактивных гамма-кетоальдегидов, образованных изопростановым путем (изокеталы) и циклооксигеназным путем (левугландины), на функцию протеасом. FASEB J 16 , 715–717, DOI: 10.1096 / fj.01-0696fje (2002).
CAS Статья PubMed Google ученый
Ламбет, Дж. Д. Ферменты NOX и биология реактивного кислорода. Nat Rev Immunol 4 , 181–189, DOI: 10,1038 / nri1312 (2004).
CAS Статья Google ученый
Itoh, K. et al. Гетеродимер Nrf2 / small Maf опосредует индукцию генов детоксицирующих ферментов фазы II через элементы антиоксидантного ответа. Сообщения о биохимических и биофизических исследованиях 236 , 313–322 (1997).
CAS Статья Google ученый
Iyer, R. S., Ghosh, S. & Salomon, R. G. Левугландин E2 сшивает белки. Простагландины 37 , 471–480 (1989).
CAS Статья Google ученый
Мурти, К. К., Фридман, Л.Р., Олейник, Н. Л. и Саломон, Р. Г. Формирование перекрестных связей ДНК-белок в клетках млекопитающих левугландином E2. Биохимия 32 , 4090–4097 (1993).
CAS Статья Google ученый
Сидорова Т.Н. и др. Реактивные гамма-кетоальдегиды способствуют неправильной укладке белков и образованию преамилоидных олигомеров в быстро активируемых клетках предсердий. J Mol Cell Cardiol 79 , 295–302, DOI: 10.1016 / j.yjmcc.2014.11.013 (2015).
CAS Статья PubMed Google ученый
Boutaud, O. et al. Простагландин h3 (PGh3) ускоряет образование олигомеров бета1–42 амилоида. J Neurochem 82 , 1003–1006 (2002).
CAS Статья Google ученый
Ставровская И.Г. и др. Реактивные гамма-кетоальдегиды, образующиеся по изопростановому пути, нарушают митохондриальное дыхание и гомеостаз кальция. Free Radic Biol Med 49 , 567–579, DOI: 10.1016 / j.freeradbiomed.2010.04.037 (2010).
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
Xiong, S. et al. Регуляторные Т-клетки способствуют опосредованному бета-катенином переходу эпителия в мезенхиму во время индуцированного радиацией легочного фиброза. Int J Radiat Oncol Biol Phys 93 , 425–435, DOI: 10.1016 / j.ijrobp.2015.05.043 (2015).
CAS Статья PubMed Google ученый
Шибер А. и Равид Т. Шаперонирующие белки для разрушения: различные роли шаперонов Hsp70 и их ко-шаперонов в нацеливании неправильно свернутых белков на протеасому. Биомолекулы 4 , 704–724, DOI: 10.3390 / biom4030704 (2014).
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
Маршалл, Р.С. и Виерстра, Р. Д. Ешьте или будьте съедены: аутофагическое положение неактивных 26S протеасом. Аутофагия , 0 , DOI: 10.1080 / 15548627.2015.1078961 (2015).
Винн Т. А. Клеточные и молекулярные механизмы фиброза. J Pathol 214 , 199–210, DOI: 10.1002 / path.2277 (2008).
CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый
Джексон, С.